Электрофоретическая схема детекции продуктов реакции



жүктеу 179.91 Kb.
Дата18.04.2016
өлшемі179.91 Kb.
: data -> file
file -> Строительные нормы республики казахстан
file -> Мұнай өнімдерінің айналымы жөніндегі декларациялардың нысандарын, оларды ұсыну және жасау қағидаларын бекіту туралы Қазақстан Республикасы Үкіметінің 2012 жылғы
file -> Сравнительный анализ флор отдельных водоемов и водотоков Любинского района Омской области
file -> Законы школьного объединения «авнюжаночка»
file -> Верхнетоемской территориальной комиссии по делам несовершеннолетних и защите их прав муниципального образования «Верхнетоемский муниципальный район»


119435 Москва, ул.Малая Пироговская, д.1, стр.3



МЕТОДИКА

проведения исследования клинического материала (биоптат слизистой желудка и

двенадцатиперстной кишки) на наличие ДНК Хеликобактер пилори

методом ПЦР
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ СХЕМА ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ
с использованием наборов реагентов:
ХЕЛИКОПОЛ (Helicobacter pylori)

ХЕЛИКОПОЛ CA (Helicobacter pylori генотип cagA)

ХЕЛИКОПОЛ VA (Helicobacter pylori генотип vacA)

ХЕЛИКОПОЛ BA(Helicobacter pylori генотип babA)

ХЕЛИКОПОЛ IA (Helicobacter pylori генотип ice A)

выделение ДНК из биопроб - «Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ»
МОСКВА 2008 г.

___________________________________________________________________________________
ПРИНЦИП РАБОТЫ МЕТОДА

В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК микроорганизма путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК-мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК.

Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозид-трифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируе-мого участка ДНК-мишени.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94оC происходит разделение цепей ДНК, затем при 57-62оС - присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72оC протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5’-3'.

В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 35 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для его детекции с помощью электрофореза.

Проведение ПЦР-анализа включает 3 лабораторных этапа:

1. обработка клинических проб (выделение ДНК);

2. постановка реакции ПЦР (амплификация);

3. детекция продуктов амплификации (в данной методике - электрофоретическое разделение продуктов в агарозном геле).

ТРЕБОВАНИЯ К ПОМЕЩЕНИЯМ И ОРГАНИЗАЦИИ РАБОТ

Требования к помещениям и организации работ изложены в Методических указаниях МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности" (Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерациии Г. Г. Онищенко 04 марта 2004г).

Требования к проведению работ с патогенными микроорганизмами изложены в Санитарных правилах СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами"1999г.


НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ и РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

1 этап - выделение ДНК из биопроб:

- ламинарный бокс 2 класса защиты;

- твердотельный термостат для пробирок 1,5 мл типа Эппендорф, поддерживающий температуру до 99оС;

- высокоскоростная центрифуга для пробирок 1,5 мл 8-12 тыс.об/мин;

- центрифуга для пробирок 50 мл 1,5-3тыс.об/мин;

- микроцетрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин (или вортекс);

- пипетки-дозаторы переменного объема ( 5-50; 20-200; 100-1000 мкл);

- вакуумный аспиратор (насос) с колбой-ловушкой;

- штатив для хранения пробирок 1,5 мл;

- штатив для пробирок 1,5 мл «рабочее место»;

- одноразовые наконечники для дозаторов до 200 мкл и до 1000 мкл;

- холодильник с морозильной камерой для хранения клинического материала;

- одноразовые перчатки;

- комплект «Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ»


2 этап - проведение ПЦР (амплификация):

- ПЦР-бокс с УФ-лампой;

- программируемый термостат амплификатор);

- микроцентрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин;

- пипетка-дозатор переменного объема 5 - 50 мкл для работы с биопробами;

- пипетки-дозаторы переменного объема ( 0,5 - 10; 5-50; 20-200; 100-1000 мкл) для приготовления рабочей смеси реагентов ;

- одноразовые полипропиленовые микропробирки 0,5 мл (или 0,2 мл) для амплификации;

- одноразовые наконечники до 200 мкл и до 1000 мкл для приготовления рабочей смеси реагентов ;

- одноразовые наконечники с фильтром (аэрозольным барьером) до 100 или до 200 мкл для биопроб;

- штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место»;

- штативы для наконечников 200 мкл;

- одноразовые перчатки;

- емкость для сброса использованных наконечников;

- холодильник с морозильной камерой для хранения исходных реагентов;

- комплект реагентов для проведения ПЦР (индивидуален для каждого возбудителя);

3 этап - детекция продуктов амплификации:

- камера для горизонтального электрофореза;

- источник постоянного тока с напряжением не менее 150 В;

- УФ-трансиллюминатор;

- СВЧ-печь для плавления агарозы;

- технические весы для взвешивания агарозы;

- аквадистиллятор;

- видеосистема для документирования гель-электрофореграмм со светозащитным кабинетом или тубусом, подключенная к персональному компьютеру;

- пипетка-дозатор переменного объема 5 - 50 мкл для нанесения образцов на гель;

- пипетка-дозатор переменного объема 100-1000 мкл;

- одноразовые наконечники до 200 мкл для нанесения образцов;

- одноразовые наконечники до 1000 мкл;

- штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место»;

- агароза, раствор бромистого этидия, 50хТАЕ буфер для приготовления геля и проведения электрофореза (или готовый комплект реагентов для электрофоретической детекции);

- пластиковая емкость большого объема для дезактивации буфера и гелей;


СОСТАВ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ для ПЦР

В состав набора реагентов входят три комплекта :



1. Комплект для пробоподготовки (выделения ДНК)

« Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ» (кат № 020104 ) (на 50 образцов):

1. Лизирующий раствор..................................................... 5 мл

2. Раствор I 25 мл

3. Раствор II 10 мл

3. Раствор III 100 мл

4. Cорбент 1 мл

5. ТЕ буфер 2.5 мл


2. Комплекты для проведения ПЦР (амплификации)

Рассчитаны на проведение анализа 50 исследуемых образцов, 5 положительных контрольных образцов и 5 отрицательных контрольных образцов.



ХЕЛИКОПОЛ (кат № 010111):

Реакционная смесь 150 мкл

Taq-полимераза (5 ед/мкл) 15 мкл

Разбавитель 1 мл

Минеральное масло 1 мл

ДНК контрольная H.pylori 25 мкл



ХЕЛИКОПОЛ СА (кат № 010113):

ПЦР-буфер 180 мкл

Раствор дНТФ 180 мкл

MgCl2 150 мкл

Смесь праймеров cagA 120 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) 15 мкл

Контрольная ДНК cagA 25 мкл

Вода деионизованная 1 мл

Минеральное масло 1 мл

ХЕЛИКОПОЛ VA (кат № 010114):

ПЦР-буфер 540 мкл

Раствор дНТФ 540 мкл

MgCl2 450 мкл

Смесь праймеров vacA s1/s2 120 мкл

Смесь праймеров vacA m1 120 мкл

Смесь праймеров vacA m2 .120 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) 40 мкл

Контрольная ДНК vacA s1/s2 (K1) 25 мкл

Контрольная ДНК vacA m1 (K2) 25 мкл

Контрольная ДНК vacA m2 (K3) 25 мкл

Вода деионизованная 3 мл

Минеральное масло .3 мл

ХЕЛИКОПОЛ ВА (кат № 010116):

ПЦР-буфер 180 мкл

Раствор дНТФ 180 мкл

MgCl2 150 мкл

Смесь праймеров babA 120 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) 15 мкл

Контрольная ДНК babA 25 мкл

Вода деионизованная 1 мл

Минеральное масло 1 мл

ХЕЛИКОПОЛ IА (кат № 010115):

ПЦР-буфер 360 мкл

Раствор дНТФ 360 мкл

MgCl2 300 мкл

Смесь праймеров iceA1 120 мкл

Смесь праймеров iceA2 120 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) 27 мкл

Контрольная ДНК iceA1 (K1) 25 мкл

Контрольная ДНК iceA2 (K2) 25 мкл

Вода деионизованная 2 мл

Минеральное масло 2 мл
3. Комплект для детекции продуктов амплификации

Для детекции продуктов амплификации можно использовать как готовые комплекты, так и отдельные реагенты.



Готовые комплекты:

Комплект №1 (кат №030106) (на 100 –150 образцов)

агароза-2х2г, 50хТАЕ буфер-25 мл, раствор бромистого этидия-30мкл



Комплект №2 (кат №030107) (на 120 образцов)

2% агарозный гель (40 лунок) –3шт, 50хТАЕ буфер-25 мл



Отдельные реагенты:

- Агароза (100г/уп; 2г/уп) (кат №030101)

- Раствор бромистого этидия (1мл/уп) (кат №030104)

- 50хТАЕ буфер (200 мл/уп; 120мл/уп) (кат №030102)

- 2% агарозный гель для электрофореза ( 40 лунок)(1шт/уп; 5шт/уп)(кат №030108)
ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. ВЗЯТИЕ, ДОСТАВКА и ХРАНЕНИЕ МАТЕРИАЛА

Исследуемый биопсийный материал опускается в стерильную сухую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.

Пробу доставить в лабораторию в течение 2-х часов (в термосе со льдом) для выделения ДНК или заморозить и хранить при температуре – 20°C не более 2 недель.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ БИОПРОБ

2.1. В 1.5 мл пробирку с биоптатом добавить 100 мкл лизирующего раствора и инкубировать, периодически встряхивая, при 55оС до полного растворения ткани (это процесс занимает от 2 до 4 часов , при необходимости инкубацию можно проводить в течение ночи при 37оС).

2.2. Осадить сконденсированные на внутренней поверхности пробирки капли жидкости центрифугированием в течение 5 сек при 8-12 тыс. об/мин. К полученному лизату добавить 20 мкл суспензии сорбента (перед добавлением суспензию тщательно перемешать на встряхивателе) и 500 мкл раствора I . (Раствор I перед использованием прогреть на водяной бане 10 мин. при температуре 50-60оС и тщательно перемешать). Полученный раствор перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин., периодически встряхивая на вортексе.

2.3. Осадить сорбент центрифугированием на микроцентрифуге в течение 15 сек при 8-12 тыс. об/мин. Удалить супернатант.

На всех стадиях обработки клинического материала удаление супернатанта производят одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи вакуумного насоса в колбу-ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т.п.)

2.4. К осадку добавить 200 мкл раствора II, перемешать смесь, осадить сорбент центрифугированием в течение 15 сек на микроцентрифуге при 8-12 тыс. об/мин., удалить супернатант.

2.5. Промыть сорбент 2 раза 1 мл раствора III , как описано в п.2.4

2.6. Пробирки поместить в твердотельный термостат и подсушить сорбент 5-10 мин при температуре 55-60оС, оставляя пробирки открытыми.

2.7. В пробирки с сорбентом добавить 50 мкл ТЕ буфера, закрыть их, тщательно перемешать на вортексе и инкубировать в течение 5 минут при 55-60оС.

2.8. Пробирки центрифугировать 15 сек при 8-12 тыс.об/мин..

Водную фазу (супернатант) использовать в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.

Водную фазу снятую с сорбента можно хранить при температуре -20оС в течение 6 месяцев.
3. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР (амплификация)

3.1. Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл), включая пробирки для положительных и отрицательного контрольных образцов

3.2. За 20-30 минут до приготовления амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для амплификации из морозильника, разморозить содержимое (желательно поместить пробирку с Taq-полимеразой в ледяную баню). Размороженные пробирки тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.

3.3. Из компонентов набора приготовить смесь реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

ХЕЛИКОПОЛ:

Разбавитель 17,5 мкл,

Реакционная смесь 32,5 мкл,

Taq-полимераза 0,2мкл



Рекомендуется готовить смесь реагентов не менее чем на 5 реакций для достоверной дозировки объема фермента
ХЕЛИКОПОЛ СА:

Вода деионизованная 14,3 мкл

ПЦР-буфер 3 мкл

Раствор дНТФ 3 мкл

MgCl2 2,5 мкл

Смесь праймеров cagA 2 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) .0,2 мкл
ХЕЛИКОПОЛ VА:

Вода деионизованная .14,3 мкл

ПЦР-буфер 3 мкл

Раствор дНТФ 3 мкл

MgCl2 2,5 мкл

Смесь праймеров 2 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) 0,2 мкл
ХЕЛИКОПОЛ ВА:

Вода деионизованная 14,3 мкл

ПЦР-буфер 3 мкл

Раствор дНТФ 3 мкл

MgCl2 2,5 мкл

Смесь праймеров babA 2 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) 0,2 мкл
ХЕЛИКОПОЛ IА:

Вода деионизованная 14,3 мкл

ПЦР-буфер 3 мкл

Раствор дНТФ 3 мкл

MgCl2 2,5 мкл

Смесь праймеров iceA1 либо iceA2 2 мкл

Tag-полимераза (5ед/мкл) 0,2 мкл
Для каждой смеси праймеров готовится отдельная амплификационная смесь.

Все компоненты добавлять отдельными наконечниками.
3.4. После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.

3.5. Добавить по 20 мкл амплификационной смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации (для ХЕДИКОПОЛ СА, VA, BA и IA—по 25 мкл).



3.6. Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.

3.7. Внести 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы (см п. выделение ДНК) в соответствующую пробирку с амплификационной смесью для проведения амплификации под слой масла.

3.8. Внести в пробирки для положительных контрольных образцов по 5 мкл соответствующего положительного контрольного образца ДНК из состава набора, а в пробирку для отрицательного контрольного образца – 5 мкл разбавителя или деионизованной воды из состава набора.

3.9. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 2250 – 4000g (1,5 –3000 об/мин) при комнатной температуре (+18 – 25оС) на микроцентрифуге-вортексе.

3.10. Перенести пробирки в прогретый до температуры +93оС программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по следующим программам:




ХЕЛИКОПОЛ

T,оС

время

циклов

94 о

Pause

 

94 о

60 сек

1

94 о

30 сек

5

50 о

30 сек

72 о

30 сек

92 о

5 сек

 

40  



50 о

10сек

72 о

15 сек

10 о

Storage

 




ХЕЛИКОПОЛ BA

T,оС

время

циклов

94 о

Pause

 

94 о

1 мин

1

94 о

1 мин

35

55 о

1 мин

72 о

1 мин

72 о

5 мин

1

10 о

Storage

 




ХЕЛИКОПОЛ СA, IA, VA

T,оС

время

циклов

94 о

Pause

 

94 о

1 мин

1

94 о

1 мин

35

для IceAA2 –40



52 о

1 мин

72 о

2 мин

72 о

5 мин

1

10 о

Storage

 

Для амплификатора Терцик: режим регулирования – точный; объем реакционной смеси – 40 мкл


4 ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза

4.1. Залить в аппарат для электрофореза ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ в 50 раз.

4.2. К 2,0 г агарозы добавить 2 мл 50х ТАЕ буфера и 100 мл дистиллированной воды.

4.3. Приготовленную смесь расплавить на электрической плите или в СВЧ-печи. Добавить к 100 мл расплавленной агарозы 10 мкл 1% раствора бромистого этидия. Перемешать.

4.4. Охладить расплавленную агарозу до температуры 50-60оС и залить в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов установить на планшет гребенку, используя зажим типа «бульдог». После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перенести планшет с гелем в камеру для проведения электрофореза.

4.5.Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата в последовательности соответствующей нумерации проб. Нанести положительные и отрицательные контроли.

4.6. Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и задать напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2см.

Визуализация результатов электрофореза

4.7. Вынуть гель из формы и перенести его на стекло УФ-трансиллюминатора.

ВНИМАНИЕ! С гелем агарозы следует работать в перчатках. Бромистый этидий является сильным мутагеном.



4.8. Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм.
5. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. В отрицательном контрольном образце (К-) полосы должны отсутствовать. Появление полосы на уровне положительного контроля свидетельствует о контаминации (загрязнении) компонентов набора.

5.2. В положительных контрольных образцах (К+) должна выявляться одна полоса, соответствующая ПК.

5.3. Анализируемые пробы:

отсутствие полосы оранжево-красного цвета строго на уровне положительного контроля (ПК) свидетельствует об отсутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе; наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю – о присутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе.

5.4. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра.

Размер фрагментов ДНК


Набор

возбудитель

фрагмент ПК, п.н.

ХЕЛИКОПОЛ

Helicobacter pylori

492

ХЕЛИКОПОЛ СА

генотип cagA

404

ХЕЛИКОПОЛ VА

генотип vacA

vacA s1: 259 + vacA s2: 286

vacA m1: 290

vacA m2: 352

ХЕЛИКОПОЛ BА

генотип babA

800

ХЕЛИКОПОЛ IА

генотип iceA

iceA1: 250

iceA2: 334


6. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ и ТРАНСПОРТИРОВКИ РЕАГЕНТОВ

6.1. Комплект «Набор для выделения ДНК из биоптата» должен храниться при +2...+8оС в течение всего срока годности (6 месяцев с даты производства). Допускается хранение и транспортировка этого комплекта при комнатной температуре не более 2 суток.

6.2. Комплекты для проведения ПЦР должны храниться при температуре минус 18-25оС в течение всего срока годности (6 месяцев с даты производства). Допускается хранение и транспортировка этого комплекта при температуре не выше 0оС не более 1,5 суток.

6.4. Комплект для электрофоретической детекции №1, агароза, 50хТАЕ-буфер и раствор бромистого этидия может храниться при комнатной температуре в течение всего срока годности (указан на этикетке).

6.5. Комплект для электрофоретической детекции №2 и готовые агарозные гели должны храниться при +2...+8оС в течение всего срока годности (6 месяцев с даты производства).

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение методики проведения исследования.



По вопросам, касающимся качества наборов реагентов, обращаться

в НПФ «ЛИТЕХ» по адресу:

119435 г.Москва, ул.Малая Пироговская, д.1, стр.3, т./ф. (495) 589-14-03







©netref.ru 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет