Галина Николаевна Кокуева Обнаружение биологически активных веществ в продуктах питания



жүктеу 321.58 Kb.
Дата01.05.2016
өлшемі321.58 Kb.
: netcat files -> File
File -> Enel Investment Holding B. V. Образование: 1999 год Scuola Superiore Enrico Mattel в Милане, Италия, диплом
File -> Российская академия медицинских наук северо-западное отделение
File -> Закона от 24. 07. 2002 г. №101 фз «Об обороте земель сельскохозяйственного назначения»
File -> Пружины для железнодорожного транспорта
File -> Синтез и необычные химические превращения фторированных траннуленофуллеренов
File -> Название коллектива
File -> Срс в контексте преподавания дисциплины «психология и педагогика»
File -> Дмитрий иванович менделеев
File -> Новости Межрайонной ифнс россии №23 по Челябинской области, для размещения на сайте Реорганизация налоговых органов
Автор Галина Николаевна Кокуева

Обнаружение биологически активных веществ
в продуктах питания

Из 109 известных в настоящее время химических элементов в живых организмах найдено более 70, из них около 20 встречается во всех типах организмов; как и в верхних слоях земной коры, в них количественно преобладают элементы с малыми атомными массами.


Таблица 1. Средний элементарный состав растений и животных (В.И.Вернадский)

Номера декад

Примерное содержание в биосфере, % на сырую массу

Элементы

Макроэлементы

I

10

O,H

II

1

C

III

0,1

N, P, K, Ca, Si

IV

0,01

Mg, S, Fe, Na, Cl, Al

Микроэлементы

V-VII

0,001- 10 -5

Mn, B, Cu, Zn, Ba, Li, Ni, Rb, F и др.

Ультрамикроэлементы

VIII-XIV

10-6 - 10-12

Mo, I, As, Ag, Hg, Au, Pb, Ra и др.

Существует определенная зависимость между распространением элементов в биосфере, их биологической ролью и положением в периодической системе Менделеева. Вещества живых организмов более чем на 99% состоят из элементов первых трех периодов этой системы, т.е. из легких элементов. Как правило, при переходе от легких к тяжелым элементам в пределах одной и той же подгруппы (например, Zn → Cd → Hg) возрастает токсичность элементов и одновременно уменьшается их содержание в биомассе. Высокой биологической активностью обладают многие соединения переходных металлов, главным образом 4 периода (с 21 по 30). Это связано с хорошо выраженной у этих элементов способностью к образованию комплексных соединений, в которых они играют роль центральных атомов. Комплексные соединения часто обладают каталитической активностью, входят в состав ферментативных молекул (например, железосодержащие гуминовые ферменты). Элементы некоторых подгрупп периодической системы могут в той или иной степени заменять друг друга в биологических процессах (например, Ca и Ba, Cl и Br).

Около 98% массы биосферы составляют четыре элемента: водород, кислород, углерод и азот. Они легко спаривают электроны и образуют прочные ковалентные связи. Малые размеры атомов этих элементов также способствуют образованию коротких, прочных химических связей. Молекулы с такими связями более устойчивы к действию химических и других факторов. Большое значение имеет также способность перечисленных элементов образовывать кратные связи (двойные, тройные), благодаря чему они превосходят многие элементы по числу и разнообразию соединений с уникальными свойствами.
Основными типами соединений, входящих в состав живых организмов, являются: белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды (жиры и жироподобные вещества), вода минеральные соли. Кроме них, в составе организмов присутствуют некоторые другие органические вещества: карбоновые кислоты, углеводороды, амины, спирты, альдегиды, дубильные вещества. И, наконец, в отдельные группы должны быть выделены вещества, присутствующие в тканях живых организмов, как правило, в небольших количествах, но играющие первостепенную роль в регуляции всего обмена веществ: гормоны, ферменты, витамины, антибиотики, фитонциды и т.п. Их иногда объединяют в группу биологически активных соединений.
Качественные реакции на белки
Методы качественного обнаружения белков основаны на двух типах реакций: а) по пептидным связям белковой молекулы; б) по аминокислотным радикалам ее. Примером реакции первого типа служит биуретовая реакция. Примером реакций второго типа являются многочисленные цветные реакции на радикалы аминокислот (реакция Сакагучи — с α-нафтолом, реакция Паули - с нитритом калия, реакция Циммермана — с о-фталевым диальдегидом, нингидриновая реакция и др.)
Биуретовая реакция.

К 1-2 мл раствора белка прибавляют двойной объем 30%-ного раствора гидроксида натрия и хорошо перемешивают. Затем из капельницы добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди и снова хорошо перемешивают. Развивается интенсивное красно - фиолетовое окрашивание, свидетельствующее о наличии пептидных, т.е. -СО-NH-, связей в молекуле белка. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.

Для сравнения проводят ту же реакцию с биуретом, который легко может быть получен при нагревании мочевины:
2 H2N-CO-NH2 → +t → NH3 + H2N-CO-NH-CO-NH2

мочевина биурет


Для этого несколько кристаллов мочевины помещают в пробирку и осторожно прокаливают в пламени газовой горелки. По охлаждении приливают в пробирку 10%-ный раствор гидроксида натрия и добавляют несколько капель 1%-ного раствора сульфата меди. После перемешивания развивается сине-фиолетовая окраска.

И в том, и в другом случае окраска вызвана образованием комплексного соединения:




Биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп.

Аналогично построено комплексное соединение меди с енолизированными пептидными группами полипептида.

Комплексы такого типа обладают преимущественно красной окраской (максимум поглощения в пределах 520-530 нм). В случае образования медных комплексов при участии трех или двух атомов азота окраска их преимущественно фиолетовая и синяя (с максимумами поглощения в пределах 540-580 нм и 615-670 нм соответственно). Поэтому окраска растворов при проведении биуретовой реакции варьирирует от синей до красной с преобладанием фиолетовой.
Нингидриновая реакция

К 1-2 мл разбавленного раствора белка приливают 3-4 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и ставят в водяную баню при 70°С на несколько минут. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.

Эта реакция обнаруживает в растворе α-аминокислоты. Сначала в результате взаимодействия аминокислоты с нингидрином возникает Шиффово основание. Затем оно претерпевает перегруппировку, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден.

Аминодикетогидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина, и образовавшееся соединение, енолизируясь, переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый Руэмана», по имени исследователя, впервые в 1910 г. изучившего эту реакцию.


Ксантопротеиновая реакция.

К 1 мл раствора белка добавляют 5-6 капель концентрированной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося белка. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется. Охлаждают смесь и осторожно добавляют к раствору, имеющему кислую реакцию, не взбалтывая, по каплям избыток концентрированного раствора аммиака или щелочи до щелочной реакции. Выпадающий вначале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет.

Ксантопротеиновая реакция происходит только при наличии в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана). Желатина, например, не содержит ароматических аминокислот и поэтому она не дает ксантопротеиновой реакции. В результате реакции нитрования по радикалам ароматических аминокислот образуются желтоокрашенные нитросоединения. Изменение желтой окраски в оранжевую в щелочной среде обусловлено появлением хромофорной группы.

Реакция Сакагучи.

Берут в пробирку 2-3 мл разбавленного раствора белка, добавляют 1 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и вслед за этим несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола. Перемешивают, приливают 0,5 мл раствора гипобромида натрия и вновь перемешивают. Развивается оранжево-красное окрашивание. Появление окраски объясняется взаимодействием α-нафтола в присутствии окислителя с гуанидиновыми группировками радикалов аргинина, имеющимся в молекуле белка.


Нитропруссидная реакция.

К 3 мл разбавленного белка приливают равный объем насыщенного раствора сульфата аммония 2-3 капли 5%-ного раствора нитропруссида натрия. Затем раствор подщелачивают несколькими каплями крепкого раствора аммиака. Если в белке присутствует цистеин, то происходит реакция, в результате которой развивается пурпурное окрашивание.


Реакция Паули.

К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 0,5%-ном растворе соляной кислоты приливают 2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2 мл разбавленного раствора белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6 мл 10%-ного раствора карбоната натрия. После смешивания растворов развивается вишнево-красное окрашивание.

Возникновение окраски обусловлено наличием в белковой молекуле остатков гистидина и тирозина.
Качественные реакции на углеводы.
Реакция Подобедова-Молиша с α-нафтолом.
Чувствительной реакцией на углеводы является реакция с α-нафтолом. Испытуемое вещество в твердом виде или в растворе должно быть свободно от волокон фильтровальной бумаги.

В пробирку берут 1 мл испытуемого раствора или крупинку твердого вещества, растворенного в 1 мл воды. Добавляют 2 капли 10%-ного спиртового раствора α-нафтола и по стенке пробирки приливают осторожно, без встряхивания, 2 мл концентрированной серной кислоты. Серная кислота опускается на дно пробирки, и на границе двух жидкостей образуется кольцо красно-фиолетового цвета. Фурфурол и 5-оксиметилфурфурол, образующиеся из углеводов под действием серной кислоты, конденсируясь с 2 моль сульфированного α-нафтола, дают триарилметановый хромоген, который окисляется серной кислотой в окрашенное хиноидное соединение.


Нафторезорциновая проба Толленса.
К 5-6 мл испытуемого раствора прибавляют 1 мл 1%-ного спиртового раствора нафторезорцина и такой же объем концентрированной соляной кислоты. Смесь осторожно нагревают до кипения и кипятят 1 мин. Затем охлаждают и взбалтывают с эфиром или бензолом.

Эфирный (бензольный) слой окрашивается в различные цвета: глюкоза, манноза, галактоза дают сине-зеленую окраску; рамноза – фиолетовую; арабиноза и ксилоза – темно-синюю; уроновые кислоты, для обнаружения которых часто применяется эта реакция, окрашивает эфирный слой в фиолетовый цвет.


Пробы на редуцирующие (восстанавливающие) сахара.
Реакция Троммера
Моносахариды в щелочной среде восстанавливают гидроксид меди (II) до гидроксида меди(I), окисляясь при этом до альдоновых кислот.

В пробирку наливают 1-2 мл раствора глюкозы и равный объем 10%-ного раствора гидроксида натрия. К смеси прибавляют при встряхивании по каплям 5%-ный раствор сульфата меди(II) до появления неисчезающей мути. Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки. Появляется желтое окрашивание (гидроксид меди(I)), переходящее в оранжево-красное (оксид меди (I)), что указывает на положительную реакцию Троммера.



Реакция с фелинговой жидкостью.

Фелингова жидкость содержит ион меди(2+) в виде комплекного соединения с тартратами. Механизм реакции редуцирующих углеводов с фелинговой жидкостью такой же, как и реакции Троммера. Преимуществом фелинговой жидкости является то, что медь при избытке реактива не выпадает в виде оксида меди(II).

К 1-2 мл раствора глюкозы приливают равный объем фелинговой жидкости и смесь нагревают до начинающегося кипения. Образуется красный осадок оксида меди(I).

Приготовление Фелинговой жидкости:

Готовят два раствора. А — 34,6 г медного мупороса в 500 мл раствора; И - 173 г сегнетовой соли и 70 г гидроксида натрия в 500 мл раствора. Растворы хранят раздельно. Перед употреблением смешивают равные объемы первого и второго раствора.
Реакция Селиванова на кетозы.

При нагревании фруктозы (и других кетогексоз) с соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол, который с резорцином образует соединение, окрашенное в вишнево-красный цвет.

Альдозы также дают эту реакцию, но реакция у них протекает медленнее и в особых условиях (температура и кислотность среды).

В две пробирки наливают по 3 мл реактива Селиванова (0,05 г резорцина растворяют в 100 мл разбавленной (1:1) соляной кислоты), в одну из них добавляют 3 капли раствора фруктозы, в другую - 3 капли раствора глюкозы. Обе пробирки помещают в водяную баню, нагретую до 80ºС, и держат в ней 8 минут. За это время в пробирке с фруктозой появляется красное окрашивание.


Реакция Барфеда (отличие восстанавливающих дисахаридов от моносахаридов)

Проба Барфеда отличается тем, что окисление сахара протекает не в щелочной среде, а в среде, близкой к нейтральной. В этих условиях редуцирующие дисахариды в противоположность моносахаридам практически не окисляются, что позволяет отличить их от моносахаридов.

К 5 мл раствора Барфеда прибавляют 1 мл раствора исследуемого сахара. Смесь нагревают на водяной бане в течение 10 мин. Моносахариды восстанавливают реактив до оксида меди(I), дисахариды реакции не дают. Следует избегать длительного кипячения, так как дисахариды в кислой среде могут гидролизоваться до моносахаридов, и в результате реакция Барфеда станет положительной.

Приготовление реактива Барфеда.

13, 3 г ацетата меди растворяют в 200 мл горячей воды. Фильтруют и к фильтрату прибавляют 1,9 мл ледяной уксусной кислоты
Реакция крахмала и гликогена с иодом

К 2-3 мл раствора крахмала прибавляют 1-2 капли раствора Люголя. Раствор окрашивается в синий цвет. Содержимок пробирки делят на три части: к первой прибавляют 1-2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, ко второй — 2 мл этилового спирта; третью часть нагревают. Во всех случаях окраска исчезает, причем в третьей пробе окраска вновь появляется при охлаждении. Реакция основана на образовании нестойкого адсорбционного соединения иода с амилозой.

В пробирку наливают 2-3 мл раствора гликогена, добавляют 1-2 капли раствора Люголя, перемешивают, появляется красно-бурое окрашивание. Окраска усиливается при добавлении нескольких кристаллов хлорида натрия, но исчезает при добавлении раствора гидроксида натрия при нагревании.

Раствор Люголя готовят растворением 1 г иода и 2,5 г иодида калия в 20 мл воды. по растворении объем раствора доводят до 100 мл.


Микрохимическое определение сахаров путем окисления периодатом.

Аналитическая ценность иодной кислоты заключается в том, что она окисляет все вторичные карбинольные группы в молекуле сахара до муравьиной кислоты, которая определяется титрованием, а первичные карбинольные группы — формальдегида, который может быть связан димедоном:

СНO-(СНОН)4-СН2ОН + IO4 -- → 5 HCOOH + H2CO + 5 IO3-

Пентозы и метилпентозы образуют по 4 моль муравьиной кислоты, гексозы — по 5 моль, фруктоза и сорбоза — по 3 моль.

В пробирку с пришлифованной пробкой помещают около 3 мг сахара и растворяют его в 5 мл воды. К полученному раствору добавляют 1мл 0,25 М раствора периодата натрия.Смесь нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения пробирки добавляют 0,2 мл этиленгликоля для разложения избытка периодата. Одновременно ставят контрольный опыт, в котором присутствуют все реагенты, кроме сахара. Раствор титруют 0,01 н раствором гидроксида натрия, применяя в качестве индикатора метиловый красный.
Качественные реакции на жиры.
Методы выделения жиров.
Обычно липиды извлекают из высушенных (обезвоженных) тканей соответствующими органическими растворителями (спирты, эфиры, бензол, толуол, бензин, ацетон, пиридин, хлороформ, четыреххлористый углерод, сероуглерод, петролейный эфир и др.). Для разделения липидов пользуются неодинаковой растворимостью их в различных растворителях: одни из них хорошо растворимы в эфире, но плохо в ацетоне (например, фосфолипиды), другие растворимы в бензоле, но не растворимы в спирте (холестерол, цереброзиды) и т.д. Резервный жир (масло) извлекается легко. Извлечь связанные липиды можно лишь после разрушения белково-липидных комплексов. Липиды из связанного состояния в свободное переводят либо путем применения гидролизующих средств, либо путем предварительного кипячения материала со спиртом. В последнем случае липиды выделяются в неизменном виде.

Наиболее простым методом определения суммарных липидов в тканях является метод длительного настаивания навесок ткани в хлороформ - метанольной смеси. По разности масс образца до и после экстракции находят процентное содержание липидов.

При выделении липидов из биологического материала происходит их окисление и деградация, приводящие к образованию побочных продуктов. Поэтому выделение липидов надо проводить быстро, в условиях, максимально исключающих влияние таких факторов, как повышенная температура, кислород воздуха, свет, загрязнение следами металлов и т.д.

Для экстракции используют смесь метанола и хлороформа, которая разрушает липопротеидные комплексы и тем самым дает возможность достаточно полно извлечь липиды.


Качественная реакция на жиры и масла.

К капле масла на часовом или предметном стекле добавляют одну каплю 1%-ного раствора осмиевой кислоты. Масло окрашивается в черный цвет. Кроме осмиевой кислоты, в качестве реактива на масла применяют краситель судан III, который окрашивает масла в различные оттенки красного цвета.

Для качественного обнаружения масла в продуктах срезы тканей (растительных или животных) смачивают одним из этих реактивов и наблюдают под микроскопом: капли масла в тканях окрашиваются в соответствующий цвет (черный от осмиевой кислоты или в красный — от судана III).
Обнаружение глицерина в жирах (акролеиновая проба)

В пробирку вносят 2-3 капли масла (жира) и прибавляют пятикратное количество безводного гидросульфата калия. Нагревают пробирку осторожно, но сильно (в вытяжном шкафу) до появления белых густых паров. Отмечают (осторожно!) резкий раздражающий запах акролеина. Если в эти пары внести кусочек фильтровальной бумаги, смоченной аммиачным раствором оксида серебра, бумага почернеет. Фильтровальная бумага, смоченная раствором фуксинсернистой кислоты, поднесенная к горлышку пробирки, постепенно окрашивается в розово-лиловый цвет.

Можно повторить этот опыт с воском вместо масла. Акролеин в этом случае не образуется.

Акролеиновая проба проводится для обнаружения в липидах глицерина. При нагревании глицерина в присутствии водоотнимающих средств (гидросульфат калия, сульфат магния, борная кислота) происходит образование непредельного акрилового альдегида — акролеина:



Определение насыщенности (ненасыщенности) жиров.

Ненасыщенность жира зависит от присутствия в его составе непредельных жирных кислот. Непредельные соединения, как известно, легко вступают в реакции присоединения, окисления, полимеризации. Обычно степень ненасыщенности определяют иодным числом. Иодное число измеряется количеством граммов иода, которое присоединяется к 100 г жира.

Для определения иодного числа титруют раствор жира в хлороформе (0,5 г жира в 3 мл хлороформа) 0,001н. раствором иода в хлороформе до появления отчетливой розовой окраски.

Качественные реакции на витамины.
Качественные реакции на витамин С (аскорбиновая кислота).

Качественные реакции на витамин С основаны на его способности легко вступать в окислительно-восстановительные реакции и восстанавливать, например, метиленовую синь, 2,6-дихлорфенолиндофенол, гексациано-(III) феррат калия, нитрат серебра и др.


Взаимодействие с метиленовой синью.

К 1 мл сока (свежевыжатого или 0,002%-ного раствора аскорбиновой кислоты) в пробирке прибавляют 1 мл 0,01%-ного раствора метиленовой сини, перемешивают и закрывают пробкой для предохранения от соприкосновения с кислородом воздуха. Пробирку помещают в термостат при 37 - 40˚С. Через некоторое время жидкость в пробирке обесцвечивается за счет восстанавления метиленовой сини в бесцветную лейкоформу и образования дегидроаскорбиновой кислоты.

Если затем бесцветный раствор метиленовой сини энергично встряхнуть, не препятствуя поступлению воздуха в пробирку, то раствор вновь приобретает синий цвет.
Взаимодействие с гексациано-(III) ферратом калия

Аскорбиновая кислота, окисляясь, восстанавливает гексациано-(III) феррат калия K3[Fe(CN)6] до гексациано-(II) феррата калия K4[Fe(CN)6], который с ионом железа в степени окисления +3 образует в кислой среде берлинскую лазурь.

К 1 мл сока прибавляют 2 капли 5%-ного раствора гидроксида калия, 2 капли 5%-ного раствора гексациано-(III) феррата калия и энергично встряхивают содержимое пробирки. Затем добавляют 6-8 капель 10%-ного раствора соляной кислоты и 1-2 капли 1%-ного раствора хлорида железа(III). Выпадает синий осадок берлинской лазури.

Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом.

К 1 мл сока прибавляют 1 мл 0,02%-ного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенол. Тщательно перемешивают, раствор обесцвечивается за счет образования лейкоформы индикатора. При дальнейшем прибавлении индикатора раствор окрашивается в розовый цвет, так как вся аскорбиновая кислота в пробе уже окислена и 2,6-дихлорфенолиндофенол больше не восстанавливается.



Реакция с иодной водой

При добавлении к раствору, содержащему витамин С, 0,1%-ного раствора I2 в KI наблюдается обесцвечивание иодной воды.


Количественное определение аскорбиновой кислоты в исследуемом материале осуществляют с помощью 2,6-дихлорфенолиндофенола, используя его титрованный раствор. По количеству реактива, израсходованного на окисление витамина С, определяют содержание последнего в анализируемом материале.

Известна методика количественной оценки аскорбиновой кислоты по результатам титрования исследуемого раствора стандартным раствором иода в присутствии серной кислоты.



Определение ионов железа в пищевых продуктах.
Железо является одним из элементов человеческого организма. В случае большого недостатка железа в организме возникает заболевание – железодефицитная анемия (малокровие), так как основная часть входящего в состав организма железа сосредоточена в красных кровяных тельцах (эритроцитах), каждая из которых содержит 280 млн. молекул гемоглобина – дыхательного пигмента. Железо содержится в мышечном белке, во многих ферментах. Главное депо железа – печень: здесь у взрослого человека может быть запасено до 1 г железа. В организме взрослого человека всего 3,5 г железа. Избыточное количество железа приводит к образованию нерастворимого в воде железосодержащего белка. Этот белок уже не может быть использован организмом и, откладываясь в тканях и органах, вызывает нарушение их функций и приводит к заболеванию.

Ионы железа были обнаружены в молоке, клубничном соке, соке красной смородины, соке черной смородины, соке крыжовника, яблочном соке, соке крапивы, в гречневой крупе, мясном соке, в шоколаде, в меде, кураге, изюме, говяжьей печени, фасоли.

Для обнаружения иона железа в молоке 50 мл его упаривают до объема 5-7 мл. Мед и шоколад берут на кончике ножа и растворяют в 2 мл воды. Чайную ложку гречневой крупы размельчают в ступке, кипятят с 10 мл воды, отфильтровывают. Фильтрат упаривают до объема 2 мл.

На хроматографическую бумагу, на расстоянии 1 см от края, на линию старта наносят капилляром каплю 1-3%-ного раствора хлорида железа(III) в качестве свидетеля. Диаметр пятен должен быть не более 5 мм. На расстоянии 1 - 1,5 см от этого пятна наносят на линию старта исследуемые вещества: каплю сока яблока, сока клубники, красной смородины, крыжовника и др. Для большего концентрирования ионов железа пробу сока наносят несколько раз, касаясь капилляром одного и того же места на стартовой линии и дожидаясь улетучивания растворителя из предварительной пробы.

Опускают приготовленную хроматограмму с нанесенными пробами в прибор для бумажной хроматографии так, чтобы смесь растворителей (элюент), состоящая из этанола и разбавленной вдвое соляной кислоты в соотношении 1:4, касалась нижнего края бумаги, но была не выше стартовой линии.

Наблюдают за подъемом элюента по бумаге. Вынимают хроматограмму из камеры, когда фронт элюента будет находиться на расстоянии 0,5 см от верхнего края хроматограммы. Слегка подсушивают ее и опрыскивают из пульверизатора 10%-ным раствором гексациано-(II)-феррата калия для обнаружения ионов Fe3+ вначале в том месте, куда должен был «пробежать» хлорид железа(III), а затем на этом же расстоянии от линии старта и остальные пробы. Появляется синее окрашивание – образование берлинской лазури. Хроматографическая подвижность ионов железа(III) – Rf =0,87 – близка к единице.



Обнаружение β-каротина в пищевых продуктах методом ТСХ.
β-каротин необходим детям для роста и сохранения хорошего зрения.

β-каротин содержится в зелени петрушки, зелени лука, шпината, морковке, рябине.

Готовят бензольные вытяжки из продуктов. Для этого растирают пестиком мякоть продуктов в присутствии тертого стекла в ступке, затем раствор декантируют или фильтруют.

На линию старта силуфоловой пластины наносят капли исследуемых растворов, помещают их в хроматографическую камеру. Элюент (система растворителей) – бензол : ацетон (3:1). (Тяга, беречь от огня!).

β-каротин имеет оранжевую окраску, поэтому специально обнаруживать его не надо. Полученные в этих условиях значения хроматографической подвижности близки к литературным данным, Rf =0,9.

При одновременном хроматографировании бензольных растворов одинаковой концентрации разных продуктов можно сделать вывод о количественном содержании β-каротина по величине пятна.


Обнаружение кофеина в пищевых продуктах (чае, кофе) методом ТСХ.

Кофеин – алкалоид, бесцветное кристаллическое вещество. В небольших дозах оно повышает работоспособность. На этом основано широкое применение чая, кофе, какао, содержащих кофеин.

Приготовить раствор чая и кофе одинаковой концентрации в воде.

Нанести пробы на силуфоловые пластины. Пластины поместить в хроматографическую камеру. Элюент – этанол. Хроматографирование идет 10 мин. Обнаружить кофеин парами иода. Rf кофеина - 0,57. Если нет свидетеля кофеина, то следует ориентироваться на литературные величины Rf в этих же условиях хроматографирования.

Из хроматограмм видно, что кофеина в чае примерно в три раза больше, чем в кофе. В зеленом чае кофеина больше, чем в черном.
Практикум

по обнаружению биологически активных веществ в продуктах питания
1. Качественное определение белка c помощью ксантопротеиновой реакции.

Реактивы и материалы:

образец сырого продукта - 5 г ( один из перечисленных: мясо курицы, утки, филе рыбы),

вода,

раствор хлорида натрия 10%, 10 мл.



концентрированная азотная кислота в капельнице с пипеткой (5 мл).

Оборудование:

предметные стекла или чашки Петри (1 штука – на один продукт),

пробирка,

стакан на 100 мл,

воронка
фильтр бумажный,

пробиркодержатель,

таблетка горючего или спиртовка или плитка или водяная баня – на выбор.

Особенности проведения реакции:

Опыт можно провести двумя способами.

В первом варианте используют образцы сырых продуктов, поместив их на чашку Петри или предметное стекло. Надо капнуть на образец мяса или рыбы каплю концентрированной азотной кислоты и подождать 1-2 минуты до появления в месте контакта продукта с кислотой характерного желтого окрашивания.

Во втором варианте используют раствор белка. Для этого 5 г мяса или рыбы мелко измельчают (можно после мясорубки), помещают в стакан, добавляют 10 мл 10%-ного раствора хлорида натрия и оставляют смесь стоять 10-15 минут при частом перемешивании, после чего отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр. В данном растворе содержится главным образом альбумин и глобулин. С раствором белка проводят классическую ксантопротеиновую реакцию при нагревании (см. стр. 5)




    1. Качественное определение белка с помощью биуретовой реакции.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы - 5 г (один на выбор: молоко, сыр, грецкие орехи, помидор, творог);

вода,

насыщенный раствор сульфата аммония — 5 мл,



раствор хлорида натрия 10%, 10 мл,

раствор гидроксида натрия (6N) - 10 мл,

раствор сульфата меди (0,5N) – 3 мл,

Оборудование:

нож или терка для измельчения,

таблетка горючего или спиртовка или плитка или водяная баня – на выбор,

демонстрационные пробирки — 2 штуки,

стакан на 100 мл,

палочка стеклянная,

пробиркодержатель.

Особенности проведения реакции:

Можно использовать образец молока без выделения из него альбуминов. А можно добавить к образцу молока равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. При этом выпадают в осадок глобулины и казеин. После фильтрования через бумажный складчатый фильтр получают раствор альбуминов.

Из других продуктов готовят водную или солевую вытяжку. Для этого продукт измельчают, заливают 10 мл дистиллированной воды или 10 мл раствора соли, настаивают 10-15 минут, декантируют или фильтруют.

Если использован раствор белка, реакция проходит быстро уже при обычных условиях. (см. стр. 3)




    1. Качественное определение восстанавливающих углеводов. Реакция Троммера.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы - 5 г (один на выбор: мед, виноградный сок, свежевыжатый сок ананаса, капуста, огурец, помидор);

вода,

раствор гидроксида натрия (6N) - 10 мл,



раствор сульфата меди (0,5N) – 3 мл,

Оборудование:

нож или терка для измельчения,

марлевая салфетка для отжима сока,

таблетка горючего или спиртовка или плитка или водяная баня – на выбор, демонстрационные пробирки — 2 штуки,

пробиркодержатель.

Особенности проведения реакции:

Эта реакция проходит легко с любым свежевыжатым соком. Если для реакции использован мед, есть вероятность отрицательной реакции Троммера в случае, если пчел «кормили» сахарным сиропом. Такой же результат может быть, если использован сок, приготовленный с большим количеством сахара.

При выполнении этого опыта особенно важно наличие сильнощелочной среды и умеренное нагревание (лучше всего — водяная баня) из-за возможности разложения гидроксида меди (II). (см. стр. 7)


    1. Качественное определение кетоз. Реакция Селиванова.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы - 5 г или 5 мл (один на выбор: мед, свежевыжатый виноградный сок, свежевыжатый сок ананаса);

фруктоза — 1 г,

глюкоза -1 г,

реактив Селиванова (0,05 г резорцина растворяют в 100 мл разбавленной (1:1) соляной кислоты) -3 мл

Оборудование:

водяная баня, нагретая до 80ºС,

демонстрационные пробирки — 2 штуки,

пробиркодержатель.



Особенности проведения реакции:

Реакция проходит легко при точном соблюдении инструкции (см. стр. 8).




    1. Качественное определение крахмала в незрелом яблоке, отсутствие крахмала в спелом яблоке.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы - 10 г незрелого яблока, 10 г спелого яблока,

раствор Люголя (1 г иода и 2,5 г иодида калия растворяют в 20 мл воды. По растворении объем раствора доводят до 100 мл) в капельнице — 5 мл.

гидроксид натрия 10%-ный раствор — 5 мл,

этиловый спирт — 5 мл,

Оборудование:

нож или терка для измельчения,

марлевая салфетка для отжима сока,

таблетка горючего или спиртовка или плитка или водяная баня – на выбор, демонстрационные пробирки — 6 штук,

пробиркодержатель,

пипетка.


Особенности проведения реакции:

Реакция основана на образовании нестойкого адсорбционного комплекса иода с амилозой, который разрушается при добавлении спирта, раствора щелочи и при нагревании. (см. стр. 9)

С помощью этой реакции можно определить степень спелости яблока. Спелость наступает, когда весь крахмал превратился в моно-, дисахариды.


    1. Качественное обнаружение и выделение жиров.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы (один из: имбирь, кокос, мякоть авокадо, грецкие орехи ) - 5 г,

неполярный или малополярный растворитель (один из: петролейный эфир, диэтиловый эфир, хлороформ, четыреххлористый углерод и др.) - 3-5 мл,

судан III — 1-2 мл раствора



Оборудование:

нож, ступка с пестиком, или терка для измельчения,

марлевая салфетка,

таблетка горючего или спиртовка или плитка или водяная баня – на выбор,

предметное стекло 1-2 шт.

пипетка,


микроскоп.

Особенности проведения реакции:

Пищевой материал надо измельчить, (имбирь и кокос натереть на мелкой терке, орехи раздавить скалкой), добавить неполярный растворитель, тщательно перемешать. Затем полученную взвесь декантировать (отфильтровать). Для обнаружения жира можно поместить каплю раствора на стекло, дать испариться растворителю, наблюдать жирные следы при растирании масла пальцем о стекло.

Можно воспользоваться реакцией с суданом III (см. стр. 10).




    1. Обнаружение ненасыщенных жирных кислот.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы (жир соленой сырой рыбы, например, семги или форели; гусиный жир) - по 2 г,

хлороформ (ацетон, диэтиловый эфир, петролейный эфир и др.)— по 3 мл на каждый жир,

раствор иода в хлороформе (0,001 н) — 30 мл

бромная вода — 10 мл

Оборудование:

весы торсионные с точностью 0,01г,

пипетка на 3 мл,

пробирки лабораторные,

бюретка.

Особенности проведения реакции:

Опыт можно провести качественно и количественно.

Для качественного обнаружения ненасыщенных жирных кислот готовят раствор жира в неполярном растворителе. Несколько капель жира рыбы смешивают с 3 мл органического растворителя. Если используется твердый (гусиный) жир, то к 1 г утиного жира добавляют 3-4 мл органического растворителя. После тщательного перемешивания раствор декантируют или фильтруют. Затем к раствору жира добавляют по каплям бромную воду. Первые капли бромной воды тут же обесцвечиваются.

Можно количественно оценить степень ненасыщенности жира, т.е. определить его иодное число. (см. стр. 11).

Берут навеску жира с точностью до 0,01 г, растворяют ее в 3-4 мл хлороформа и титруют полученный раствор 0,001н. раствором иода в хлороформе до появления отчетливой розовой окраски. В отсутствии бюретки можно посчитать количество капель раствора иода, необходимое для реакции с образцом жира. Определив объем одной капли данной пипетки, можно достаточно точно вычислить иодное число жира.

Особенно показательны результаты этого опыта, если стоит задача сравнить степень насыщенности разных жиров.




    1. Количественное определение витамина С (аскорбиновой кислоты).

Реактивы и материалы:

пищевые материалы (свежевыжатый сок ананаса, капусты, водная вытяжка чеснока, имбиря) - по 5 мл,

стандартный раствор иода (0,1 моль/л) готовится предварительно из фиксанала — 1000 мл,

раствор иода в KI — 0,1% - 100 мл

раствор серной кислоты 6н. - 50 мл,

водный раствор крахмала 1% - 10 мл

дистиллированная вода

Оборудование:

весы аналитические,

бюретка,

пипетка Мора на 10 мл,

пипетка градуированная на 5 мл (1мл, 3 мл)

колба мерная на 1000 мл,

колба мерная на 100 мл,

колбы конические на 100 мл — 3 шт.

мерный цилиндр на 10 мл (25 мл, 50 мл),

медицинская груша,

пробирки лабораторные.

Особенности проведения реакции:

Витамин С можно обнаружить разными способами (см. стр. 11-12).

Одной из самых легких и доступных реакций обнаружения аскорбиновой кислоты является реакция с раствором иода. Опыт можно провести как качественно, так и количественно.

Для качественной оценки к определенной порции исследуемого раствора по каплям добавляют 0,1% раствор иода в КI. Если в растворе присутствует аскорбиновая кислота, то наблюдается обесцвечивание раствора иода. Особенно показательно использовать такой вариант для сравнения разных образцов.

Эту же реакцию можно использовать и для количественного определения аскорбиновой кислоты в исследуемом растворе.

Для этого берут порцию исследуемого раствора, содержащего примерно 0,1- 0,2 г аскорбиновой кислоты, добавляют 30-40 мл дистиллированной воды, 10 мл 6н серной кислоты, 2-3 мл раствора крахмала и тщательно перемешивают. Затем титруют этот раствор стандартным раствором иода до появления синего окрашивания. Как правило, опыт повторяют трижды для получения сходящихся результатов и для расчета используют среднее арифметическое значение. По результатам титрования можно рассчитать содержание аскорбиновой кислоты в исследуемом растворе.




    1. Определение железа методом ТСХ в яблоке, ананасе, гранате, крапиве в присутствии свидетеля.
      Реактивы и материалы:

пищевые материалы (свежевыжатые соки яблока, граната, ананаса, крапивы) - по 2 мл, вместо сока крапивы можно использовать отвар сухой крапивы.

10%-ный раствор гексациано-(II)-феррата калия — 5 мл,

раствор хлорида железа (III), 1-3% -ный — 2 мл,

элюент: этанол — соляная кислота (1:2) - (1:4) — 5 мл.



Оборудование:

капилляры — 4 шт. (по числу продуктов)

силуфоловые пластины — 1 шт.,

хроматографическая камера или стакан узкий на 100 мл, накрытый стеклянной пластиной,

карандаш простой,

линейка,

ножницы или нож,

пульверизатор,

картонный экран (30*20 см).

Особенности проведения реакции:

Хроматографическое определение железа в продуктах питания проводят, строго следуя инструкции (см. стр. 13). Для успешного результата эксперимента очень важно использовать соответствующие количества веществ. Поскольку в качестве свидетеля используют 1-3%-ный раствор хлорида железа(III), важно добиться примерно такой же концентрации железа в каждой капле исследуемых растворов на хроматограмме. Поэтому имеет смысл ставить пробу на старт несколько раз в одну и ту же точку с небольшим перерывом во времени для испарения растворителя. Необходимо записать, сколько капель исследуемого раствора находится в каждой пробе, чтобы по окончании расчетов вычислить естественное содержание железа в данном образце.




    1. Определение бета-каротина методом ТСХ в соке морковки, шпинате.

Реактивы и материалы:

пищевые материалы (свежая морковь, лист шпината) - по 5 г,

бензол — 10 мл,

элюент: бензол — ацетон (3:1) — 5 мл.



Оборудование:

нож, терка, ступка с пестиком для измельчения

тертое стекло — 5 г,

фильтр — 2 шт.,

капилляры — 2 шт.

силуфоловые пластины — 1 шт.,

хроматографическая камера или стакан узкий на 100 мл, накрытый стеклянной пластиной,

карандаш простой,

линейка,

ножницы или нож.



Особенности проведения реакции:

Опыт проводят строго по инструкции (см. стр. 14). Особое внимание следует обратить на работу с бензолом (ТБ!!!). Имеет смысл заменить бензол в этой методике на ксилолы или толуол.

Есть данные, что в раннем, весеннем шпинате бета-каротин отсутствует. А вот в морковке он определяется легко и очень наглядно.
Использованная литература:


      1. Березин Б.Д., Березин Д.Б. Курс современной органической химии. Учебное пособие для вузов. М., Высшая школа., 2001.

      2. Луценко Н.Г. Практикум по технологии косметических средств. Биологически активные вещества в косметике.М., Школа косметических химиков, 2004.

      3. Основы биохимии. Учебник для студ. биол. спец. ун-тов. А.А.Анисимов и др.; М.:Высш. шк., 1986.

      4. Филиппович Ю.Б. и др. Практикум по общей биохимии. Уч. пособие для студ. хим. спец. М.:Просвещение, 1982.

      5. Сборник исследовательских работ ХIV Всероссийского конкурса юношеских исследовательских работим. В.И.Вернадского. М., 2007.

      6. Мелентьева К. Фармацевтическая химия. М., Медицинв, 1968.

      7. Основы аналитической химии. Практическое руководство. Под ред. Ю.А.Золотова. М., Высш.шк. 2003.

      8. Скурихин И.М., Нечаев А.П. Все о пище с точки зрения химика. Справ. Издание. М., Высш.шк., 1991.

      9. Химия. Большой энциклопедический словарь. Гл.ред. И.Кнунянц. М., Большая Российская энциклопедия, 1998.

      10. Энциклопедия для детей. Том 17. Химия. Гл.ред. В.А.Володин. М., Аванта, 2000.



Имбирь. Извлечение эфирного масла

Имбирь натереть на мелкой терке, добавить неполярный растворитель (петролейный эфир), декантировать (отфильтровать). Каплю раствора на стекло, дать испариться растворителю, наблюдать жирные следы при растирании пальцем о стекло.


Утка

  1. Определение ненасыщенных жиров.

К 3 г утиного жира добавляют 3-4 мл органического растворителя ( ацетон, хлороформ, диэтиловый эфир, петролейный эфир и др.). После тщательного перемешивания раствор декантируют и добавляют по каплям бромную воду. Первые капли бромной воды тут же обесцвечиваются.

  1. Определение белка.

Проводят ксантопротеиновую реакцию. На кусок утиного мяса капают каплю концентрированной азотной кислоты. В течение 1-2 минут появляется характерное желтое окрашивание.
Яблоки

  1. Определение железа

  2. Проверка спелости (по реакции с иодом – нет синего окрашивания крахмала) весь ли крахмал перешел в сахар

  3. + иодная вода _ обесцвечивание; аскорбинка

  4. рН -?


Творог

  1. Обнаружение кальция в твороге

  2. Обнаружение молочной кислоты

  3. Обнаружение казеина


Капуста

  1. Определение витамина С

  2. Определение в капусте сахаров (в молодой и осенней – сравнить


Мед

  1. Определение фруктового и виноградного сахара в меде.


Морепродукты

  1. Определение полиненасыщенных жирных кислот в мясе гребешков

  2. Определение цинка в гребешках

«С» восстанавливает 2,6-дихлорфенолиндофенол, который в Н+ – красная окраска, а при восстановлении обесцвечивается в ОН- - синяя окраска

титруют в Н+ щелочным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенол до появления розового окрашивания

Реакция Селиванова на фруктозу



Сух. Резорцин + 2капли НСl + 2 капли 0,5%-го раствора фруктозы и нагревать до начала кипения. Из желтого в красное окрашивание

Картошка

  1. Определение крахмала в картошке

  2. Определение водорастворимых белков по Лоури

  3. Определение алкалоида соланина (кач. цв. р-ция)


Рыба

  1. Определение полиненасыщенных жирных кислот в жире рыбы

  2. Определение иода в морской рыбе


Морковка-свекла

  1. Определение каротина в морковке

  2. Определение бетаина в свекле

  3. Выделение бетаина из свеклы


Хлеб

  1. Определение крахмала


Масло

  1. Масло — эмульсия жира в воде. Можно ли разрушить ее, расслоить химическим способом?

  2. Белки в сливочном масле?

  3. Ненасыщенные жирные кислоты?


Имбирь

  1. Извлечение эфирного масла из имбиря и определение терпенов

  2. Определение общей антиоксидантной активности ( вытяжки из него)

  3. Определение кетонов


Орехи

  1. Экстракция масел из орехов

  2. Присутствие фенола в скорлупе кешью


Сыр

  1. Определение белка, аминокислот

  2. Определение жира


Ананас

  1. Определение аскорбинки в ананасе

  2. Определение железа и фосфора?

  3. Сахара -13%


Курица

  1. белки


Соль

  1. Осмос. Три кубика картошки в а) воде; б) крепком соленом растворе; в) в изотоническом растворе.

  2. температура воды; воды с солью, вода сольдом и солью

  3. отмыть чашку, закоричневевшую от заварки горстью соли


Клюква-брусника

  1. Определение бензойной кислоты

  2. определение кислот вообще

  3. определение пектиновые вещества


Утка

  1. Определение белка

  2. Определение жиров

  3. Определение железа в мясе


Кофе

  1. Определение кофеина


Яблоки

  1. Определение спелости яблока по иодкрахмальной пробе

  2. Определение железа

  3. Определение суммарной антиоксидантной активности

  4. Определение растворимых пектиновые


Кокос

  1. Извлечение кокосового масла из мякоти кокоса

  2. Определение суммарного минерального состава кокосового молока


Гранат

  1. Определение лимонной кислоты

  2. Определение железа

  3. Определение суммарного минерального состава


Рис

  1. Определение крахмала в сыром рисе и рисовом отваре.


Грецкие орехи

  1. выделение масла из ядра грецкого ореха


Авокадо

  1. Определение ненасыщенных жирных кислот


Чеснок

  1. Определение антиоксидантной способности чеснока (витамин С)


Обнаружение биологически активных веществ в продуктах питания
Качественное определение белка в:

мясе курицы, утки, рыбы, вытяжке из ореховой массы, грибах, сыре (водной вытяжке), молоке, помидорах, картошке, твороге.


Качественное определение восстанавливающих углеводов в: меде, виноградном соке, свежевыжатом соке ананаса, капусте (ранней и осенней), огурцах, помидорах.

Отсутствие углеводов - в орехах, авокадо.



Качественное определение невосстанавливающих сахаров в:

сахарном песке, соке из пакета.


Качественное определение крахмала в:

сыром рисе и рисовом отваре, в хлебе — черном и белом, помидорах,



в незрелом яблоке.

Необнаружение крахмала в спелом яблоке.
Качественное обнаружение и выделение жиров в:

кокосе, в мякоти авокадо, в ядрах грецких орехов, имбире, сыре, курином и гусином жире.
Обнаружение ненасыщенных жирных кислот в:

жире свежепосоленной сырой рыбы, морских гребешках, мякоти авокадо, оливковом, подсолнечном, кукурузном маслах, гусином жире.
Определение органических кислот в:

клюкве, бруснике, ананасе, гранате, твороге, шпинате, яблоках, помидорах.

Отсутствие кислот в авокадо.

Определение витамина С (аскорбиновой кислоты) в:

свежевыжатом соке ананаса, яблока; водной вытяжке чеснока, соке капусты, имбире

Необнаружение витамина С в соке из пакета.
Определение бета-каротина методом ТСХ в:

соке морковки, шпинате.
Определение кофеина методом ТСХ в:

кофе и чае разных сортов и качества


Определение железа методом ТСХ в:

гречневой крупе, клубнике, яблоке, ананасе, гранате, шоколаде



©netref.ru 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет