Ізденістер, №2 исследования, НӘтижелер 2013 результаты



жүктеу 5.37 Mb.
бет1/26
Дата31.03.2016
өлшемі5.37 Mb.
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   26
: material
material -> Сабақтың тақырыбы : Допты алып жүрудің түрлері. Сабақтың мақсаты : Допты алып жүруді үйрету, әдісін-тәсілін үйрету
material -> Маңғыстау облысы Қарақия ауданы Жетібай ауылы №3 орта мектептің бастауыш сынып мұғалімі Самамбетова Қарлығаш Ашық тәрбие сағаты 2-сынып Тақырыбы
material -> Сабақ тақырыбы: М.Әуезов
material -> ТӨлеби ауданы №7 жалпы орта білім беретін мектебі коммуналдық мемлекеттік мекемесі
material -> Сабақтың тақырыбы: Жамбыл өмірі мен шығармашылығы. Сабақтың мақсаты
material -> Абай Құнанбаевтың табиғат лирикасындағы қазақ ауылының көрінісі
material -> «Қарағайдың қарсы біткен бұтағы» атты қайсар ақын
material -> Сабақтың тақырыбы : Сыр сүлейі Нұртуған Сабақтың мақсаты: Сыр сүлейі Нұртуғанның шығармаларымен таныстыру
material -> Сабақтың мақсаты: Оқушыларға ұлы А. Құнанбаевтың шығармашылығымен
material -> Сабақтың тақырыбы: Қазақстан халқының XVIII-XIX ғасырлар аралығында рухани мәдениетінің дамуы
ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ АГРАРЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ





ІЗДЕНІСТЕР, № 2 ИССЛЕДОВАНИЯ,

НӘТИЖЕЛЕР 2013 РЕЗУЛЬТАТЫ

ТОҚСАН САЙЫН НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ,

ШЫҒАРЫЛАТЫН ВЫПУСКАЕМЫЙ

ҒЫЛЫМИ ЖУРНАЛ ЕЖЕКВАРТАЛЬНО


1999 ж. ШЫҒА ИЗДАЕТСЯ

БАСТАДЫ С 1999 г.

Ветеринария и животноводство

• ЗЕМЛЕДЕЛИЕ, АГРОХИМИЯ, КОРМОПРОИЗВОДСТВО,

АГРОЭКОЛОГИЯ, ЛЕСНОЕ ХОЗЯЙСТВО

• МЕХАНИЗАЦИЯ И ЭЛЕКТРИФИКАЦИЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

ПЕДАГОГИКА

• ЭКОНОМИКА



АЛМАТЫ, 2013



Журналдың бұл нөмірінде қазіргі аграрлық ғылымның әр түрлі бағыттары бойынша талдау және эксперименттік зерттеулерінің нәтижелері жарияланып отыр. Материалдарды еліміз бен шет елдік жоғары оқу орындарының, ҚР АШМ ғылыми-өндірістік және ҚР БҒМ ғылыми орталықтарының ғалымдары орындаған.

В журнале опубликованы резуль-таты аналитических и эксперимен-тальных исследований по различным направлениям современной аграрной науки. Материалы представлены уче-ными высших учебных заведений страны и ближнего зарубежья, научно-произ-водственных центров МСХ РК и научных центров МОН РК.



Редакция алқасы:

Т.И. Есполов

(бас редактор)



Қ.М.Тіреуов

(бас редактордың орынбасары)



Ш.Ә. Әлпейісов

(бас редактордың орынбасары)



О.А. Абралиев, А.Қ. Апушев,

А.Қ. Атыханов,

Д.З. Ахметова (Ресей),

С.Б. Байзақов, С.М. Борбасов,

М.Ж. Божинов (Болгария),



Е. Виетсма (Нидерланды),

Б. Ганеш (АҚШ),Р.Е. Елешев, А.М. Ерімбетова, М.Н. Жоланов, П.Ж. Жүнісбеков,



Е.Ж. Кентбаев, С.А. Кешуов, А.Қ. Қозыбай,

Ч.Б. Кушеев (Ресей),



А.Ж. Мақбұз, Б.М. Махатов,

Ғ.Р Мәдиев, К.М. Мұхаметкәрімов, Д. А. Мельничук (Украина),

Г.П. Новикова (Ресей),

С.Н. Олейченко,

А.Г. Рау, Ж.С. Садықов,

А.Д. Серікбаева,

Ә.Ә. Сәмбетбаев,

А.Ө. Серікбаев,

Ж.Ж. Сүлейменов,

Л.Ө. Тастемірова,

Ж.К. Төлемісова, А.Т. Тілеуқұлов, Е. Хорска (Словакия), А. Хоховский (Польша)


Редакционная коллегия:
Т.И. Есполов

(главный редактор)



К.М. Тиреуов

(зам. главного редактора)



Ш.А. Альпейсов

(зам. главного редактора)


О.А. Абралиев, А.К. Апушев,

А.К. Атыханов,

Д.З. Ахметова (Россия),

С.Б. Байзаков,С.М. Борбасов, М.Ж. Божинов (Болгария),

Е. Виетсма (Нидерланды),

Б. Ганеш (США), Р.Е. Елешев, А.М. Еримбетова,



М.Н. Жуланов,

П.Ж. Жунисбеков,

Е.Ж. Кентбаев, С.А. Кешуов, А.К. Козыбай, Ч.Б. Кушеев (Россия), А.Ж. Макбуз,

Б.М. Махатов, Г.Р Мадиев,

К.М. Мухаметкаримов,

Д.А. Мельничук (Украина),

Г.П. Новикова (Россия),

С.Н. Олейченко, А.Г. Рау,

Ж.С. Садыков, А.Д. Серікбаева,

А.А. Самбетбаев,

А.У. Серикбаев,

Ж.Ж. Сулейменов,

Л.У. Тастемирова,

Ж.К. Тулемисова,

А.Т. Тлеукулов, Е. Хорска

(Словакия), А. Хоховский (Польша)
Editorial board:
T.I. Yespolov (chief editor)

K.M. Tireuov (deputy editor)

S.A. Alpeisov (deputy editor)
O.A. Abraliyev, A.K. Apushev,

A.K. Atykhanov,

D.Z. Ahmetova



(Russian Federation),

S.B. Baizakov, S.M. Borbasov, M.Z. Bojinov (Bulgaria),

E. Wietsma (The Netherlands),

B. Ganesh (USA), R.Y. Eleshev, A.M. Erimbetova,

M.N. Zhulanov,

P.Z. Zhunisbekov,

Y.Z. Kentbaev, S.A. Keshuov,

A.K. Kozibay, C.B. Kushyev (Russian Federation),

A.Z. Makbuz, B.M. Mahatov,

G.R. Madiyev,

K.M. Mukhametkarimov,

D.A. Melnichuk (Ukraine),

G.P. Novikova (Russian Federation), S.N. Oleichenko, G.Rau, Z.S. Sadykov,

A.D. Serikbayeva,

A.A. Sambetbayev,

A.U. Serikbayev,

Z.Z. Suleimenov,

L.U. Tastemirova,

Z.K. Tulemisova,

A.T. Tleukulov, E. Horska (Slovakia),

A. Hohowski (Poland)





© «Айтұмар» баспасы, 2013. © Издательство «Айтұмар», 2013.

ВЕТЕРИНАРИЯ И ЖИВОТНОВОДСТВО

УДК 636.7: 591.144.4


Н.С. Алдаяров1, А.Ш. Иргашев1, Ж.И. Казиев2
Кыргызский национальный аграрный университет (КНАУ) им. К.И. Скрябина1

Казахский национальный аграрный университет2
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ИНКАПСУЛИРОВАННЫХ ВТОРИЧНЫХ ОРГАНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ЧУМЕ ПЛОТОЯДНЫХ
Аннотация. С помощью отдельных маркеров иммуногистохимии (CD3, CD79άcy, MAC387, PCNA, Ki67, AK10H3) изучено морфофункциональное состояние периферических органов иммуногенеза при чуме собак. В селезенке и лимфатических узлах сильно истощены Т-, В-зоны, очаговые некротические массы обнаружены в местах локализации В-зон, что указывает на полное уничтожение иммунной системы организма собаки, что и служить доказательство иммунносупрессорной природы вируса чумы.

Ключевые слова: чума плотоядных, лимфотропизм, нейротопизм, эпителиотропизм, иммуноморфология, мультисистемность.

Введение

Одним из наиболее распространенных болезней собак вирусной этиологии является чума плотоядных. Вирус чумы плотоядных (ВЧП) - пантропный, не чувствительный к различным раздражителям вирус c одиночно-скрученной РНК-ой, относящиеся к роду морбилливирусов и семейству парамиксовирусов (PringleC.R., 1999).

ВЧП обладает уникальными свойствами как - эпителиотропность, лимфотропность, нейротропность и благодаря такой способности вирус практически заражает все органы систем, тем самым вызывая мультисистемное поражение организма собаки.

ВЧП внутри клеток выявляется в виде внутрицитоплазматических или ядерных телец включений, которые обнаруживаются в иммунокомпетентных, эпителиальных, мезенхимальных, нейроэндокринных и гематопоэтических клетках (T. Kuboetal, 2007).

Лимфотропизм и иммуносупрессорная природа ВЧП доказана результатами многих научных исследований (S. Krakowka et al, 1985; K. Hirama et al, 2003).

ВЧП не только обладает отдельными уникальными свойствами, но и отличается способностью заражать широкий круг животных дикой популяции в естественных условиях. Так, ВЧП обнаружен: у диких африканских собак, красной лисицы, каменной куницы, барсука, енотовидной собаки, хорька, койотов, волков, полярных медведей, американских диких свиньей, азиатских слонов, норок, львов, леопардов, тигров, гепардов, дельфинов, тюленей и у морских свиней (M.J.Appelеtal, 1994; K. Frölichetal, 2000; B.C. Damienetal, 2002; T.H. Noonеtal, 2003; R.L. Zarnkeetal, 2004; J.B. Stanton еtal, 2004; E.M. Geseetal, 2004; M. Tryland еtal, 2005; O. Oni, еtal, 2006; A.S. Hammerеtal, 2007; P. Wohlsein еtal, 2007). Природный резервуар вируса – это постоянная угроза эпизоотии инфекции среди дикой популяции псовых, отдельных представителей кошачьих и водных млекопитающих, а также и домашних собак.

Такая широкая распространенность ВЧП среди животных дикой фауны раскрывает ее суть и актуальность научных исследований связанных с данной проблемой, способствует разносторонним и совместным научным исследованиям биологов и ветеринаров, а также повышает значение исследований данной биомедицинской проблемы.

Материал и методы исследования

Данная работа выполнялась на кафедре ВСЭ, гистологии и патологии факультета ветмедицины и биотехнологии КНАУ им. К.И. Скрябина, в Институте ветеринарной патологии высшей ветеринарной школы города Ганновер (ФРГ, 2004), в лаборатории иммуногистохимии и гематологии Института ветеринарной патологии в городе Гиссен (ФРГ, 2005, 2006) и в Институте ветеринарной патологии Цюрихского университета (Швейцария, 2007-08).

Тканевые пробы от основных периферических органов (селезенка, поверхностные и глубокие лимфатические узлы) были получены от 6 здоровых и 58 собак больных чумой плотоядных (гистологический подтвержденный позже) в течение 2004-2007 года в Бишкеке.

Макро- и микроскопическим исследованиям подверглись все органы, в том числе и периферические органы иммуногенеза. Трупы собак вскрывали по общепринятой методике, визуально осматривали все орга­ны. Кусочки органов фиксировали в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина.Обезвоживание кусочков производилось в специальной машине в вакууме и в обычных условиях нашей кафедры.

Серийные срезы готовились на санном микротоме толщиной 4-6 мкм и микротомах новой модификаций толщиной 2 мкм.

Для иммуногистохимических окрашиваний срезов восстановление антигена производили с помощью автоклава Паскаль (20 минут, +980 С и 2 минут при +1250 С под давлением) при использовании антиген восстанавливающих буферных растворов PH 9.0 (EDTA или основной буферный раствор PH 9.0) и цитратный буфер (PH 6.0) в соответствии с инструкцией производителя. При иммуногистохимическихисследованиях были использованы АВС, РАР и SABC методы для выявления Т- (CD3), В-лимфоцитов (CD79αcy), макрофагов (MAC 387) и пролиферацию клеток (Ki-67, PCNA) и ВЧП (CDV).

Для выявления Т-лимфоцитов использовали антитело Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3. Code No. A. 0452; для выявления В-лимфоцитов - антитело Monoclonal Mouse Anti-Human B cell, CD 79ά cy. Clon HM 57. Code S 1699; для выявления макрофагов – антитело Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clon MAC 387. Code Nr. M0747; для выявления пролиферацию клеток - антитело Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). ClonPC10. Code-Nr. M 0879, MonoclonalMouseAnti-HumanKi67. Clone MIB-1; для выявления вируса чумы собак (ВЧС) использовали антитело - mono AK 10H3.

Окрашивание производили вручную во влажной камере. Срезы дополнительно окрашены гематоксилином Майера, дифференцировали 1% раствором соляной кислоты (на 700ном спирте), затем окрашенные гистологические срезы в предметных стеклах покрывали специальной жидкостью (глицерин - желатином)и высушивали на сушильном шкафе (550 С). Предметные стекла с окрашенными срезами были покрыты прозрачной пленкой на специальной машине с помощью ксилола.

При положительной реакции клетки были окрашены в красный или коричневый цвета. Ядра клеток были окрашены дополнительно в синий цвет с помощью гематоксилина Майера.

Анализ патогистологических препаратов проводили под световым микроскопом Nikon ECLIPSE 50i при слабом и сильном увеличениях. Микрофотографии были получены видеокамерой со специальным устройством Nikon прикрепленной к микроскопу Nikon ECLIPSE 50i и присоединенной к монитору компьютера марки LG, а также с помощью СКАНСКОПА (в лаборатории Института ветеринарной патологии города Цюрих), далее применяя компьютерную программу AperioImageScope получали микрофотографии желаемого увеличения (х4,х10,х20и х40).

Протоколы вскрытия и анализ гистопрепаратов зафиксированы в специальном рабочем журнале.

Результаты исследования

Патогистологически установлено, что в пульпе селезенки четко выделяются некротизированные участки разной формы и величины (Рис. 1.А). Эти участки окружены макрофагами и отдельные макрофаги находятся среди некротизированной массы. Отмечается увеличение количества макрофагов. ВЧП позитивные клетки встречаются по всей пульпе диффузно и более компактное заселение зараженных клеток заметны В-зоне лимфоцитов (среди и вокруг некротизированной массы) (Рис. 1.В). Не наблюдаются активно функционирующие и первичные лимфоидные фолликулы. Отмечается сильное сокращение количества В-лимфоцитов и нарушение структуры лимфоидных фолликулов (Рис. 1.Д). Наряду с клетками подвергнутые некрозу отмечается высокая степень апоптозных фигур и апоптосомы (Рис. 1.Б). Т-зона клеток также подвержена сильной атрофии. Т-клетки наблюдаются по всей пульпе селезенки диффузно (Рис. 1.Г). Пролиферативная активность Т- и В-лимфоцитов низкая. Строма или скелет органа не нарушена (коллагеновые, эластические и ретикулярные волокна). Отмечается заметное увеличение нейтрофилов. Встречаются эозинофильные клетки и лаброциты.



А

Б

В


Д

Г

Рис. 1. Парафиновые срезы селезенки собаки. Глубокое структорное нарушение белой пульпы селезенки при заражении с ВЧП. А – некроз В-зоны и истощение Т-зоны белой пульпы. Гем. и эозин х10; Б – значительное количество фигур апоптоза и апоптосомы. Гем. и эозин х40; В – ВЧП позитивные клетки. CDVmonoAK 10H3х10; Г – диффузное заселение Т-клеток в пульпе органа x20; Д – некроз и истощение В-зоны белой пульпы, CD79 позитивные клетки. CD79αсу x20.

Микроскопически как в селезенке, в лимфатических узлах отмечаются основные патологические альтерации в Т- и В-зонах лимфоидной ткани, т.е. в основном в корковом веществе органа. Корковое вещество сильно атрофировано. Картина между фолликулярной и паракортикальной зонами стерты. Обе зоны истощены и заселены диффузной лимфоидной тканью, где встречаются большое количество апоптозных фигур и апоптосомы, которые в основном хорошо просматриваются в фолликулярной зоне (Рис. 2.А). Пролиферативная активность клеток низкая (Рис. 2.В). В обеих зонах диффузно и компактно отмечаются активизированные макрофаги (Рис. 2.Е). В отдельных участках коркового вещества лимфатического узла наблюдаются некротизированные массы в местах расположений лимфоидных фолликул. На антиген ВЧП дают позитивную реакцию в массовом порядке клетки фолликулярной зоны коркового вещества (Рис. 2.Б), а в паракортикальной зоне и в мозговом веществе ВЧП позитивные клетки расположены диффузно. Т- и В-лимфоциты по всей паренхиме располагаются диффузно или группами. Из-за истощений лимфоидной ткани в паренхиме органа хорошо просматривается эндоэпителиальный остов лимфатического узла. Отмечаются нейтрофилы, единичные эозинофилы и лаброциты.




В

Б

А


Е

Д

Г

Рис. 2. Парафиновые срезы лимфатического узла собаки. Микроструктурное нарушение лимфатического узла при заражении с ВЧП. А – фолликулярная зона коркового вещества с рыхлой лимфоидной тканью (фигуры апоптоза и клетки с вирусными тельцами включениями). Гем. и эозин x40; Б – ВЧП позитивные клетки коркового вещества органа. CDVmonoAK 10H3x10; В – низкая пролиферативная активность лимфоидной ткани органа.PCNAx20; Г – истощение CD3 позитивных клеток в паракортикальной зона коркового вещества органа. CD3 x20; Д – В-клетки в фолликулярной зоне коркового вещества. CD79αсу х20; Е – диффузная инфильтрация макрофагами коркового вещества органа. MAC387 х10.



Обсуждение результатов. Как известно, организм здорового животного или человека защищается от различных антигенов с помощью отдельных физиологических механизмов (механические и химические) и факторов неспецифической и специфической защиты.

При воздействии на организм внешних и внутренних антигенов, в первую очередь реагируют регионарные центры иммунного контроля, т.е. селезенка, многочисленные лимфатические узлы, кровь и САЛТ органов различных систем организма. Такая функциональная обязанность периферических органов иммуногенеза подтверждается анатомическим расположением их в организме.

У млекопитающих основными инкапсулированными периферическими органами иммуногенеза являются селезенка и многочисленные региональные (поверхностные и глубокие) лимфатические узлы.

Селезенка, являясь полифункциональным и периферическим органом лимфоцитопоэза, играет важную роль биологического фильтра, где иммунокомпетентные клетки белой пульпы обеспечивают генетический контроль протекающей крови по артериям селезенки. Также она является местом резервуара и разрушения (старые истратившие свои функциональные свойства и поврежденные) эритроцитов.

Лимфатические узлы расположены в разных участках организма на границе внутренней и внешней среды на путях возможного внедрения в организм антигенов (М.Р., Сапин 1982). Многочисленные поверхностные и глубокие лимфатические узлы, располагаясь в различных регионах (зонах) организма и каждый по отдельности снабжает определенный участок организма иммунокомпетентными клетками, с помощью которых контролируется организм от антигенного загрязнения (иммунный гомеостаз).

Периферические органы иммунной системы расположены в стратегических зонах по ходу возможного проникновения антигена.

Серьезные нарушения целостности организма отражается в их морфофункциональной деятельности.

В норме Т-клетки постоянно находится в активном морфофункциональном состоянии, они локализованы в основном Т зоне, в красной пульпе диффузно и они дают CD4+ позитивную реакцию и в В-зоне, что связано с их функцией.

Отмечаемые активные вторичные лимфоидные фолликулы (в обоих органах) в норме объясняется с тем, что гуморальный иммунитет также обезвреживает антигены эндогенного и экзогенного характера, которые встречаются в обычных условиях (против различных антигенов поступивших с пищей, с воздухом и т.д.).

В структурном и функциональном отношении Т- и В-зоны селезенки и лимфатических узлов одинаковы.

ВЧП приводит к макроскопическим и микроскопическим изменениям органов иммунной системы организма, включая атрофию тимуса, истощение Т- и В-зон с потерей вторичных лимфоидных фолликул, гиперплазию ретикулярных клеток, некроза лимфоидных фолликулов, формирование гигантских клеток c внутрицито-плазматическими и внутриядерными тельцами включениями в клетках ретикулярной и лимфоидной ткани (AppelM.J., 1994; KrakowkaS.etal, 1985).

Наши исследования подтверждают исследования вышеизложенных авторов.

По результатам экспериментальных исследований при выздоровлении животного от чумы плотоядных лимфоидная ткань восстанавливается обратно (McCulloughB. etal, 1974).

Анализируя данные собственных исследований и сравнивая их с литературными источниками, можно сказать, что чума плотоядных являясь мультисистемной болезнью, имеет очень сложный патогенез. Мы считаем, что система местного иммунитета и основные периферические лимфоидные органы не справляются с этой болезнью благодаря уникальной способности ВЧП. ВЧП обладает способностью преодолевать плазматическую мембрану и проникать в цитоплазму клеток покровного эпителия и лимфоцитов, что и подтверждаются данными отдельных исследователей. В цитоплазме вышеуказанных клеток они размножаются и развиваются. Лимфоидные клетки при встрече с вирусом заражаются ими и они, генетически изменяясь, не выполняют свои непосредственные функции, циркулируя по кровеносным и лимфатическим сосудам, поражают остальные периферические органы иммуногенеза. Видимо, развивается прогрессирующий иммунодефицит организма. Тому свидетельствуют морфологически количественные и качественные изменения лимфоидной ткани восновных периферических органов иммуногенеза.



Выводы

Ссылаясь на данные литературы и собственного исследования можно сделать вывод, что сильное истощение Т- и В-зоны лимфоидной ткани основных периферических органов (селезенка и лимфатические узлы) при заражении собаки ВЧП указывает на полное уничтожение защитных клеток организма и указывает на то, что ресурсы, используемые для формирования лимфоидных клеток полностью исчерпаны. Это доказывает иммуносупрессорную природу ВЧП.






Литература

  1. Сапин М.Р. Лимфатический узел как орган иммунной системы //В кн.: Современный проблемы регенерации. Йошкар-Ола. 1982. С. 5-13.

  2. Appel M.J.G. et al. Canine distemper epizootic in lions, tigers and leopards in North America /J. Vet. Diag. Inves., 1994. 6. 277-288.

  3. Damien B.C. et al. Prevalence of antibodies against canine distemper virus among red fox in Luxembourg / J. of Wildlife Disease, 2002. 38 (4). 856-859.

  4. Distribution of inclusion bodies in tissue from 100 dogs infected with canine distemper virus / T. Kubo, Y. Kagawa, H. Taniyama, A. Hasegawa // Vet. Med. Sc., 2007. 69(5). - P. 527-529.

  5. Frölich K. Et al. Epizootiological investigations of canine distemper virus in free-ranging carnivores from Germany /J. Vet. Microbiology, 2000. 74. 283-292.

  6. Gese E.M. et al. Serologic survey for canine infectious diseases among sympatric swift foxes (Vulpesvelox) and coyotes (Canis la trans) in Southerastern Colorado / J. of Wildlife Disease, 2004. 40(4). 741-748.

  7. Hammer A.S. et al. Immunohistochemical detection of 3 viral infections in paraffin-embedded tissue form mink (Mustelavison): a tissue-microarray-based study /The Canadian journal of Vet. Res.,2007. 71.8-13.

  8. Hirama K. et al. Cytotoxic T-lymphocyte activity specific for hemagglutinin (H) protein of canine distemper virus in dogs /J. Vet. Med. Sci., 2003. 65(1). 109-111.

  9. Krakowka S., Axthelm M.K., Johnsen G.C. Canine distemper virus /J. Comp. Path. of Viral Diseases, 1985. 2. 1245-1254.

  10. McCullough B., Krakowka S., Koestner A. Experimental canine distemper virus-induced demyelination /J. Lab. Investigation., 1974. 31. 216-222.

  11. Noon T.H. et al. Serologic survey for antibodies to canine distemper virus in collared peccary (Tayassutajacu) population in Arizona / Journal of Wildlife disease, 2003. 39(1). 221-223.

  12. Oni O. et al. Canine distemper virus antibodies in the Asian elephant (Elaphasmaximus) /J. Vet Record, 2006. 159. 420-421.

  13. Pringle C.R. Virus taxonomy /J. Arch. Virol., 1999. 142(2). 421-429.

  14. Stanton J.A. et al. Retrospective differentiation of canine distemper virus and phocine distemper virus in Phocids / J. Worldwide Disease, 2004. 40(1). 53-59.

  15. Tryland M. et al. Serologic survey for selected virus infections in polar bear at Svalbard /Journal of Wildlife disease, 2005. 41(2). 310-316.

  16. Wohlsein P. et al. Distemper in a dolphin /J. Emer. Inf. Dis., 2007. 13(12). 1959-1961.

  17. Zarnke R. L., Hoef J.M., DeLong R.A. Serologic survey for selected disease agent in wolves (Canis lupus) from Alaska and Yukon territory / J.

  18. Worldwide Disease, 2004. 40(4). 632-638.

Н.С. Алдаяров, А.Ш. Иргашев, Ж.И. Казиев


ИММУНДЫ ЖҮЙЕНІҢ ИНКАПСУЛЯЦИЯЛЫ ЕКІНШІЛІК АҒЗАЛАРЫНЫҢ ЕТҚОРЕКТІЛЕР ОБАСЫНДАҒЫ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬДЫ ҚАЛПЫ
Иммуногистохимияның маркерлері (CD3, CD79άcy, MAC387, PCNA, Ki67, AK10H3) көмегімен ит обасы кезінде перифериялық ағзалары иммуногенезінің морофофункционалды қалпы зерттелген. Көк бауыр және лимфа түйіндерінде Т- және В белдеулері едәуір азғындаған. В - белдеу орныққан аймақтарда ошақты некрозды тіндер анықталған, бұл ит ағзасы иммунды жүйесінің толық жойылғандығын білдіреді, ол - оба вирусының иммунносупрессорлы табиғатынан екендігін дәлелдейді.

Кілт сөздер: ет қоректілердің обасы, лимфотропизм, нейротопизм, эпителио-тропизм, иммуноморфология, мультижүйелілік.
N.S. Aldajarov, A.Sh. Irgashev, Zh.I. Kazyev
THE MORPHOFUNTIONAL STATE OF ENCAPSULATE SECONDARY IMMUNE SYSTEM ORGANS IN CANINE DISTEMPER
Using some immunohistochemical markers (CD3, CD79άcy, MAC387, PCNA, Ki67, AK10H3) were studied morphofunctional state of peripheral organs of immune system in canine distemper. T and B areas in the spleen and lymph nodes were strong cachexied, focal necrotic mass were revealed in the places where located B areas and that indicated fully destruction of immune system in dogs organism and that serve as proof of immunosuppressive nature of canine distemper virus.

Key words: plague carnivore, limfotropes, neurotop, epiteliotrop, immunomorphology, multisystem.

УДК 338.436.32



Ш.А. Альпейсов

Казахский национальный аграрный университет
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ УПРАВЛЕНИЯ КАЧЕСТВОМ И

БЕЗОПАСНОСТЬЮ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРОДУКЦИИ В КАЗАХСТАНЕ


Аннотация. В условиях открытого рынка, а Казахстан стал страной с открытой рыночной экономикой, первостепенное значение приобретает достижение конкурентоспособности агропромышленного комплекса и продовольственной безопасности страны. С этих позиций должны быть обоснованы направления и масштабы инновационной деятельности в аграрном секторе страны. Сложившееся положение предполагает необходимость осуществления активной инновационной деятельности в различных отраслях АПК и во всех сферах производства.

Ключевые слова: экология, инновация, сельскохозяйственное производство, пищевая безопасность, земледелие, животноводство.

Введение

По данным международных экспертов ООН к 2050 году население планеты составит 9 млрд. человек, а площади под сельхозугодия будут неуклонно сокращаться.

Чтобы обеспечить всех продовольствием, объем сельскохозяйственного производства должен увеличиться на 70%.

Казахстан занимает 9-е место по земельным площадям в мире. Сельское хозяйство является одной из ключевых отраслей нашей экономики. Поэтому от уровня развития аграрного сектора зависит благосостояние страны и качество жизни ее жителей.

Сегодня стало очевидным, что деградация почв приобрела угрожающие размеры и является одной из основных угроз глобального экологического кризиса. Из-за хищнического и безграмотного отношения к почвам идет процесс разрушения почвенного слоя, который называют «тихим кризисом планеты». А ведь 90 процентов продуктов питания человек получает именно в результате использования плодородия почв в земледелии и животноводстве.

Также остро стоит вопрос и по качеству питьевой воды. Дефицит и загрязненность воды в бассейнах рек Казахстана ухудшает качество сельскохозяйственной продукции и отрицательно влияет на состояние здоровья населения страны.

По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно в мире из-за низкого качества воды умирает около 5 млн. человек. Инфекционная заболеваемость населения, связанная с водоснабжением, достигает 500 млн. случаев в год. Это дает основание назвать обеспечение населения доброкачественной водой в достаточном количестве проблемой номер один и требует принятия неотложных мер по решению проблемы комплексного использования и охраны водных ресурсов в Казахстане.

Все вышеизложенное является причиной увеличения с каждым годом всемирного внимания к вопросам качества и безопасности сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов. И на этот вызов безопасности человеческой жизни необходим адекватный ответ [1].



Материалы и методы исследования

Ведущий сельскохозяйственный вуз нашей страны – Казахский национальный аграрный университет, который более 80 лет готовит специалистов для сельского хозяйства, прекрасно осознает ключевые проблемы отрасли. Для их успешного решения в нашем вузе созданы шесть научно-исследовательских институтов по разным направлениям развития АПК.

Программой развития университета на 2011-2015 годы предусмотрено внедрение инновационных технологий, в рамках которой утвержден и перспективный план мероприятий по внедрению системы оценки качества пищевой безопасности страны. Поэтому приоритетным направлением для университета остается оценка качества сельскохозяйственной продукции и сырья, которую осуществляет «Лаборатория пищевой и экологической безопасности» - одна из структур Казахстанского – Японского инновационного центра. В его составе функционируют также лаборатории оценки качества воды, электронной микроскопии и ветеринарная научно-диагностическая лаборатория, которая в основном работает в направлении диагностики заболеваний сельскохозяйственных животных, оценки качества фармацевтических препаратов, выявления генетически модифицированных организмов (ГМО) и т.д. [2].

Для обеспечения научной и учебной базы, повышения качества и эффективности научно-исследовательских работ, реализации и продвижения форсированных индустриально-инновационных проектов в области биотехнологии, нанотехнологий и новых материалов, агротехнологий, генно-молекулярных и других важнейших стратегических научно-технологических приоритетов, проведения совместных исследований по международным программам был подписан Меморандум о сотрудничестве с японскими концернами «JEOL» и «Shimadzu» - ведущими производителями лабораторного оборудования в мире.

Центр назван Казахстанско-Японским отчасти потому, что 80 процентов оборудования поставлено из Японии в рамках вышеупомянутого Меморандума, причем, на льготных условиях, с обучением персонала и установкой на месте. А 20 процентов оборудования приобретены в США. В целом, благодаря приобретенному оборудованию, в лаборатории созданы все условия для ускоренной идентификации микроорганизмов, на которую в обычных лабораторных условиях уходит много времени. Наши приборы имеют, своего рода, экспресс возможности, что позволит значительно сократить время на идентификацию объектов. Научно-исследовательская и инновационная деятельность Казахстанско-Японского инновационного центра осуществляется в рамках приоритетных направлений научно-технического развития, утвержденных Высшей научно-технической комиссией (ВНТК) при Правительстве Республики Казахстан:


  • Нанотехнология и новые материалы;

  • Биотехнология;

  • Цитология и Генетика;

  • Микробиология и вирусология;

  • Ветеринарная медицина и санитария;

  • Агроинженерия;

  • Материаловедение;




  • Биологическая, органическая и неорганическая химия.

В задачи Казахстанско-Японского инновационного центра входит:

проведение исследований в области:



  • нанотехнологий;

  • проведения независимой экспертизы качества пищевой и экологической безопасности, согласно международным требованиям;

  • идентификации генно-модифицированного материала, уровня содержания гормонов, витаминов, бактерий и микологических агентов в агропромышленных изделиях;

  • изучения состояния окружающей среды, распространения в окружающей среде патогенных микроорганизмов;

  • участия в обучении и переквалификации специалистов, внедрения полученных знаний в дальнейшей деятельности ВУЗов Казахстана;

  • коммерциализации агротехнологий, реализации инновационных проектов, интеграции в международное научно-техническое пространство;

  • развития научно-технического сотрудничества с зарубежными странами, проведения совместных исследований по международным программам;

  • оказания содействия научному потенциалу университета в решении приоритетных проблем сельского, лесного и водного хозяйства республики;

  • проведения лабораторных исследований по заказам предприятий и организаций, научно-исследовательских центров и институтов, отдельных ученых и других физических лиц.

В связи с актуализацией вопросов по охране окружающей среды университетом приобретен микробиологический анализатор системы Sherlok (система идентификации микроорганизмов за счет анализа жирных кислот). В отличие от других существующих моделей микробиологических анализаторов (таких, как Multi Scan и др.) данная система является референтной и позволит выполнять арбитражные и аналогичные функции. Результаты автоматизированного анализа жирных кислот не уступают (а в некоторых случаях и превосходят) в точности анализу основного генетического материала живых клеток - молекул ДНК, что в настоящее время является эталоном достоверности при идентификации биологического материала. Микробиологический анализатор системы Sherlok можно использовать при идентификации трудно идентифицируемых организмов окружающей среды, проверке качества продуктов питания, в ветеринарной медицине и фитосанитарии.

База данных анализатора разработана научно-исследовательским институтом инфекционных болезней Вооруженных Сил США (USAMRIID) и содержит сведения о более, чем 2200 видов микроорганизмов. Она включает в себя специальную базу данных Bioterrorism Library, позволяющую быстро и точно идентифицировать несколько важнейших биологических видов особо патогенных микроорганизмов, которые могут быть использованы как средство осуществления актов биотерроризма и ведения биологической войны [3].

Для проверки качества продуктов питания в базе данных анализатора содержатся данные о сотнях видов организмов, развивающихся в пищевых продуктах и патогенных для человека, из родов Listeria, Bacillus, Campylobacter, Clostridium, Salmonella, Lactobacillus. Это больше, чем может предложить любой другой бактериологический анализатор. По ветеринарному направлению в базе данных содержатся сведения о Campylobacter, Рasteurella, Haemophilus, Brucella, Streptococcus, Bordetella и многих других видах микроорганизмов, патогенных для животных. По фитопатологии в базу данных включены сведения о пяти основных группах фитопатогенных организмов. Помимо этого в ней есть сведения о наиболее патогенных для растений видах Xanthomonas и Pseudomonas.

Заключение

Таким образом, резюмирую вышеизложенное можно отметить, что Казахский национальный аграрный университет вносит свой вклад в решение проблем пищевой и экологической безопасности Казахстана.

Литература


  1. Всеобщее управление качеством: учебник для вузов / О.П. Глудкин и др.- М.: Радио и связь, 1999-600с.

  2. Государственный стандарт Республики Казахстан. СТ РК ИСО/МЭК 17025-2007. Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий.

  3. Онищенко Г.Г. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности.

Методические указания. – М., 2004г.
Ш.А. Әлпейісов
ҚАЗАҚСТАНДАҒЫ АУЫЛ ШАРУАШЫЛЫҚ ӨНІМНІҢ ҚАУІПСІЗДІГІ МЕН САПАСЫН БАСҚАРУДЫҢ ӨЗЕКТІ МӘСЕЛЕЛЕРІ

Бәсекеге қабілетті агроөнеркәсіп кешені мен азық-түлік қауіпсіздігі жағынан ашық нарық жағдайында Қазақстан алдыңғы қатарлы ашық нарықтық экономикалық елдер қатарындағы орындарға ие. Елдің аграрлық секторында нақты бағыттар мен инновациялық қызметтердің көлемі осы дәлелдерден айқын көрінеді. Агроөнеркәсіп кешендерінің әртүрлі салалары және өндірістің барлық шеңберінде қалыптасқан жағдай күрделі жағдайларда белсенді инновациялық қызметті қажет етеді.



Кілт сөздер: экология, инновация, ауыл шаруашылық өндірісі, азық-түлік қауіпсіздігі, егіншілік, мал шаруашылығы.
Sh.A. Alpeisov
TOPICAL ISSUES OF QUALITY AND SAFETY MANAGEMENT OF AGRICULTURAL PRODUCTS IN KAZAKHSTAN
Conclusion Such a way Summarizing the above, Kazakh National Agrarian University contributes to the solution problems of food and environmental security in Kazakhstan.

Key words: ecology, innovation, agricultural productions, food safety, agriculture, stock-raising.

УДК 619:616-07/619.3



М.И. Богданова

РГП "НИИ проблем биологической безопасности" КН МОН Республики Казахстан
получение иммуноглобулина к вирусу КАТАРАЛЬНОЙ ЛИХОРАДКИ ОВЕЦ для лабораторных тест-систем
Аннотация. В результате проведенных исследований из специфических сывороток животных с использованием различных методов были выделены иммуноглобулины к вирусу КЛО. Для выделения вирусспецифических иммуноглобулинов из специфических сывороток использовали несколько методов (спиртовое осаждение по Кону, сернокислым аммонием). Активность и специфичность выделенных иммуноглобулинов была исследована РДП, а также дана их сравнительная оценка в ИФА.

В результате, для выделения наиболее активных и специфичных вирусспецифических иммуноглобулинов из всех испытанных методов наиболее пригодным оказался метод спиртового осаждения по Кону.


Ключевые слова: Катаральная лихорадка овец (КЛО), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция диффузионной преципитации (РДП)

Введение


Вирус катаральной лихорадки поражает жвачных животных – крупный рогатый скот, коз, овец, оленей, среди животных инфекция распространяется посредством кровососущих насекомых из рода Culicoides, восприимчив к заболеванию и человек. Наиболее сильно симптомы болезни проявляются у овец.

Диагноз на блютанг ставят на основа­нии данных эпизоотологического, клини­ческого и патологоанатомического обследования, а также результатов лабо­раторных исследований - выделение вируса из органов и тканей больных осо­бей, или обнаружение вирусспецифических антител в сыворотке крови больных животных.

В настоящее время в серологической диагностике вируса КЛО применяются реакция диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА) [1, 2, 3, 4]. Для диагностики большинства вирусных инфекций широко применяется иммуноферментный анализ (ИФА). Благодаря ИФА решены многие важные научные проблемы ветеринарии и биологии [3]. В свою очередь чувствительность и специфичность этого метода зависит от качества используемых в реакции диагностических препаратов (иммуноглобулины и конъюгаты) [5].

В настоящей работе представлены результаты экспериментов по выделению вирусспецифического иммуноглобулина к вирусу КЛО с использованием различных методов, пригодного для постановки ИФА при обнаружении антигена данного вируса.



Материалы и методы

Вирус. В работе использовали вирус катаральной лихорадки овец, эпизоотический штамм "RT/RIBSP-07/16" серотип 16, выделенный от мелкого рогатого скота в 2007 году в Республике Таджикистан.

Культуры клеток. Для культивирования вируса КЛО и получения вируссодержащих суспензий с целью приготовления культурального специфического антигена была использована перевиваемая линия клеток почки зеленой мартышки (VERO), выращенная в 1,5 литровых матрасах стационарным методом.

Животные. В качестве доноров специфических антител применяли взрослых овец местных пород.

Выделение иммуноглобулина спиртовым методом Кона

Осаждение вирусспецифического иммуноглобулина из сыворотки крови по методу спиртового осаждения по Кону проводится трехкратным осаждением различными концентрациями спирта (26 и 53%) [6].

Выделение иммуноглобулина сернокислым аммонием

Для осаждения вирусспецифического иммуноглобулина из сыворотки крови трехкратным осаждением 2,78 М раствором сернокислого аммония[6].



Результаты и обсуждение

Специфические сыворотки для выделения иммуноглобулинов были получены на овцах, после их гипериммунизации штаммом"RT/RIBSP-07/16" вируса катаральной лихорадки овец серотип 16. В качестве нормальной сыворотки использовали сыворотки крови от здоровых мелких жвачных животных. Для иммунизации животных использованы специфические антигены, полученные путем инфицирования культуры клеток почки зеленой мартышки (Vero) эпизоотическим штаммом "RT/RIBSP-07/16" серотип 16 вируса катаральной лихорадки овец с последующим трёхкратным термолизисом и 100% концентрированием. Результаты активности и специфичности сыворотки крови от овец представлены в таблице 1.


Таблица 1 – Активность и специфичность гипериммунных сывороток в РДП

Исследуемые сыворотки



Контрольные антигены

АС

КЛО №1


АС

КЛО №2


АС

ЧМЖЖ №3


АН

КЛО №1


специфическая сыворотка крови овцы №1 против вируса КЛО

1:32

1:32

-

-

специфическая сыворотка крови овцы №2 против вируса КЛО

1:16

1:32

-

-

Примечания 1. «-» - отрицательный результат. 2. «АС» - антиген специфический.

3. «АН» - антиген нормальный.


По данным таблицы можно сделать вывод, что полученные специфические сыворотки против вируса КЛО на овцах оказались довольно активными и специфичными в РДП.

Для выделения вирусспецифических иммуноглобулинов из специфических сывороток использовали несколько методов (спиртовое осаждение по Кону, сернокислым аммонием).

Активность вирусспецифических иммуноглобулинов, выделенных различными методами, исследовали в РДП, результаты предоставлены в таблице 2.


Таблица 2 – Активность вирусспецифических иммуноглобулинов, выделенных различными методами в РДП

Контрольные

антигены


Методы осаждения иммуноглобулинов

спиртовой

по Кону


сернокислый аммоний




Овечья №1

Овечья №2

Овечья №1

Овечья №2

Специфический

1:64

1:32

1:16

1:8

Нормальный

-

-

ц

1:2

Примечание: «-» - отрицательный результат.

Из данных таблицы видно, что вирусспецифические иммуноглобулины, выделенные по методу спиртового осаждения Кона, показали высокую активность и специфичность, по сравнению с другим методом, который оказался малоэффективным и в тоже время показал неспецифичный фоновый уровень.

В дальнейшем проводили исследования по сравнительной оценке иммуноглобулинов, выделенных различными методами с помощью ИФА. Результаты представлены в таблице 3.

Для этого специфическими иммуноглобулинами, выделенными различными методами были сенсибилизированы лунки планшет в концентрации 30 мкг/мл.

Постановку ИФА при КЛО проводили по следующей схеме:

- Обработка лунок планшет 1% раствором БСА в течение 1 часа.

- Внесение в лунки планшет контрольных антигенов вируса КЛО, контакт 18 часов при 4ºС 16-18часов.

- Наслаивали в лунки планшет вирусспецифический иммунопероксидазный конъюгат при КЛО, в рабочем разведении с добавлением 1% БСА, контакт 1час при 37ºС.

- Внесение в лунки планшет готового раствора субстрата АБТС.

- Учитывание результатов ИФА на фотометре марки «Multiskan Flow».
Таблица 3 – Активность вирусспецифических иммуноглобулинов в ИФА.

Контрольные

антигены


Методы осаждения иммуноглобулинов

спиртовой

по Кону


сернокислым аммонием




Овечья №1

Овечья №2

Овечья №1

Овечья №2

Специфический

1:3200

1:800

1:1600

1:320

Нормальный

-

-

+

+

Примечание: «-» - отрицательный результат.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, что для постановки прямого метода ИФА наиболее активные и специфичные иммуноглобулины получены методом спиртового осаждения по Кону. Иммуноглобулины, выделенные сернокислым аммонием, оказались не пригодными, так как в ходе постановки ИФА показали неспецифическую реакцию с нормальным антигеном.



Выводы

В результате проведенных исследований из специфических сывороток животных с использованием различных методов были выделены иммуноглобулины к вирусу КЛО. Активность и специфичность выделенных иммуноглобулинов была исследована РДП, а также дана их сравнительная оценка в ИФА.

Таким образом, для выделения наиболее активных и специфичных вирусспецифических иммуноглобулинов из всех испытанных методов наиболее пригодным оказался метод спиртового осаждения по Кону.
Литература


        1. Мамадалиев С.М., Кошеметов Ж.К., Керембекова У.Ж., Нурабаев С.Ш., Хайруллин Б.М., Касенов М.М., Ажибаев А.Ж. Применение иммуноферментного метода для ретроспективной диагностики чумы мелких жвачных животных. Актуальные вопросы диагностики болезней животных. Специальный выпуск материалы второй международной конференции. С. 256-261. г. Алматы - 2005г.

        2. Бакулов И.А. Эпизоотическая ситуация в мире по особо опасным болезням животных к концу ХХ столетия //Материалы межд. науч. - практ. конференция г. Покров - 2000г.

        3. Васильев А.В., Непоклонова И.В. Иммуноферментный метод в диагностике вирусных инфекций//Ветеринария, 1982, №8, с. 63-65

        4. Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ //Соросовский образовательный журнал. -1999. -№12. -с. 9-15

        5. Пономарева. Н.А, Нечаева А.С. «Гамма-глобулин» - Москва. 1985г.

        6. Фримель Г. Иммунологические методы. – М.: Медицина, 1987.-С.390-412.

М.И. Богданова
Зертханалық тест жүйелері үшін Қойдың

катаралды безгегіне қарсы иммуноглобулин алу


Катаральды қой безгегіне ИФТ әдісін қою үшін иммуноглобулиндер әртүрлі әдістермен бөлініп, ең қолайлы әдісі анықталынды.

Кілт сөздер: катаралды қой безгегі, иммуноферментті талдау (ИФТ), дифузды преципитация реакциясы (ДПР)
M.I. Bogdanova
RECEIVING IMMUNOGLOBULIN TO THE VIRUS CATARRHAL

FEVER SHEEP FOR LABORATORY TEST SYSTEMS


Developed various of methods for isolation of immunoglobulins with bluetongue, suitable for the production by ELISA

Key words: Catarrhal fever of sheep, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), reaction of a diffusive pretsipitation (RDP).
УДК 619:616-07/619.3

М.И. Богданова
РГП "НИИ проблем биологической безопасности" КН МОН Республики Казахстан
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ИФА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА КАТАРАЛЬНОЙ ЛИХОРАДКИ ОВЕЦ
Аннотация. Из антисыворотки к вирусу КЛО выделяли иммуноглобулины с использованием нескольких методов. На основе выделенного активного гамма-глобулина приготовлен вирусспецифический иммунопероксидазный конъюгат.

С применением приготовленных диагностических препаратов были проведены исследования по отработке ТФ-ИФА для обнаружения антигена вируса КЛО. В ходе, которых были отработанные оптимальные временные и температурные параметры постановки прямого варианта ИФА, подобраны буферные растворы и рабочие концентрации компонентов реакции, а также изучена чувствительность и специфичность полистироловых планшетов различных фирм-производителей.

С использованием полученных препаратов разработан метод ИФА, позволяющий выявлять группоспецифические антигены вируса блютанга в различных вируссодержащих материалах.

Ключевые слова: иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноглобулин, конъюгат.

Введение

Группа возбудителей блютанга (синий язык, катаральная лихорадка овец) входит в состав Orbivirus семейства Reoviridae. Блютанг по определению МЭБ, отнесен к заболеваниям списка А, а также вирус блютанга и еще два вируса рода Orbivirus – Чангиола и Орунго отнесены ко 2-ой группе патогенности для человека. В настоящее время известны 24 серотипа возбудителя блютанга, которые вызывают сходную клиническую картину у зараженных восприимчивых животных. К вирусу восприимчивы овцы, крупный рогатый скот, олени, ламы и другие виды диких жвачных животных [1].

Для диагностики катаральной лихорадки овец большое значение имеет серологический анализ. Наиболее простым в исполнении и легко воспроизводимым являются реакции диффузионной преципитации и связывания комплемента, но они малочувствительные, реакция нейтрализации является длительной, трудоемкой и требует для постановки культуру клеток.

Однако эти методы не позволяют проанализировать структурно-функциональную организацию возбудителя, что является причиной не всегда достоверных результатов исследований вновь выделенных изолятов. ТФ-ИФА в этом плане обладает рядом существенных преимуществ - высокая чувствительность, специфичность и экспрессность метода, возможность автоматизации процессов реакции и универсальность иммуноферментных конъюгатов[7]. Применение ТФ-ИФА в ветеринарной практике для специфической диагностики и индикации многих вирусных инфекций животных, подтвердило его широкие возможности для обнаружения бактериальных и вирусных антигенов и антител к ним, токсинов, гормонов и других биологически активных веществ [2,3,4].

В связи с этим, целью данной работы являлось разработка ТФ-ИФА на основе диагностических препаратов (сыворотка, гамма-глобулин и конъюгат), для обнаружения антигена вируса КЛО.

Материалы и методы

Вирус. В работе использовали вирус катаральной лихорадки овец, эпизоотический штамм "RT/RIBSP-07/16" серотип 16, выделенный от мелкого рогатого скота в 2007 году в Республике Таджикистан.

Культуры клеток. Для культивирования вируса КЛО и получения вируссодержащих суспензий с целью приготовления культурального специфического антигена была использована перевиваемая линия клеток почки зеленой мартышки (VERO), выращенная в 1,5 литровых матрасах стационарным методом.

Животные. В качестве доноров специфических антител применяли взрослых овец местных пород.

Антиген. Для иммунизации животных использовали концентрированный очищенный антиген, в качестве стимулятора иммуногенеза использовали сапонин.

Вирусспецифический гамма-глобулин выделяли спиртовым осаждением по методу Кона и сернокислым аммонием [5-6].

Вирусспецифический иммунопероксидазный конъюгат получали по методу Wilson и Nakane[7]. Для конъюгации вирусспецифических антител использовали пероксидазу хрена фирмы «Biozyme laboratories» (Ukraine) с чистотой RZ = 2,6-3,4 и удельной активностью по белку от 650 до 1400 Eд/мг.

Реакция диффузионной преципитации (РДП). Постановку реакции проводили по общепринятой методике.



Результаты и обсуждение

Для разработки лабораторных тест-систем важную роль играет качество (специфичность и активность) диагностических препаратов, используемых в эксперименте. В связи с этим, нам необходимо было приготовить из вируссодержащей суспензии концентрированный очищенный антиген для иммунизации животным, с целью получения специфической антисыворотки. В результате проведённых исследований был отработан оптимальный метод очистки и концентрирования антигена с помощью осаждения 10% сернокислым аммонием. Для получения антисыворотки к вирусу КЛО предварительно, за 1 месяц до гипериммунизации, животных иммунизировали вируссодержащей суспензией КЛО с активностью – 6,5 lg ТЦД50/см3 , затем проводили трехкратное введение очищенного антигена в возрастающей дозе (80-900 мкг). Материал вводили внутримышечно в область предлопаточных лимфоузлов с интервалом между введениями в 2-3 недели в комплексе с сапонином (0,05%). Оценку активности и специфичности полученной сыворотки проводили в РДП. Активность специфической сыворотки, полученной по данной схеме, составила в РДП – 1:32.

Из полученной антисыворотки выделяли вирусспецифические иммуноглобулины с использованием нескольких методов (спиртовым осаждением по Кону, сернокислым аммонием). Активность вирусспецифических иммуноглобулинов, исследовали на активность и специфичность в РДП. Результаты этих исследований представлены в таблице №1.

Таблица 1 – Оценка активности и специфичности гамма-глобулинов, выделенных спиртовым методом Кона и сернокислым аммонием



Метод выделения гамма-глобулинов

Активность в РДП

AgS

AgN

Спиртовое осаждение по Кону

1:32

-

Сернокислый аммоний

1:16

-

Примечания: 1. «АgS» – антиген специфический. 2. «АgN» – антиген нормальный.

3. «-» – отрицательный результат.



Представленные в таблице №1 данные свидетельствуют о том, что наиболее активные гамма-глобулины выделены с помощью спиртового осаждения по методу Кона, активность которых составила в РДП – 1:32.

На основе выделенного гамма-глобулина приготовлен вирусспецифический иммунопероксидазный конъюгат. Рабочая активность приготовленного конъюгата в ИФА составила – 1:50.

С применением приготовленных диагностических препаратов (гамма-глобулин, конъюгат, антигены нормальные и специфические) были проведены исследования по отработке ТФ-ИФА для обнаружения антигена вируса КЛО. В ходе, которых были отработанные оптимальные временные и температурные параметры постановки прямого варианта ИФА, подобраны буферные растворы и рабочие концентрации компонентов реакции, а также изучена чувствительность и специфичность полистироловых планшетов различных фирм-производителей.

Отработанный вариант ИФА включает сенсибилизацию лунок планшетов вирусспецифическим иммуноглобулином, взятым в рабочей концентрации, в течение 16-18 ч при 4°С в 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) с рН - 9,6. Затем следует трёхкратная отмывка лунок планшета 0,01 М фосфатно-буферным солевым раствором (ФСБ) с добавлением 0,1% твина-80 (ФБСТ). Внесение контрольных и испытуемых проб антигенов. Инкубация антигенов с лунками планшета в течение 4 ч при 37°С или 18 ч при 4°С. Пятикратная отмывка и внесение конъюгата в рабочем разведении с добавлением 0,01% БСА. Выдерживание планшетов с конъюгатом в течение 1,5 ч при 37°С, пятикратная отмывка и добавление рабочего раствора субстрата АБТС. Так же установлено, что оптимальным режимом инкубации субстрата пероксидазы (АБТС) с конъюгатами для слабо положительных проб является 60 минут, оптическая плотность положительного контроля должна быть не ниже 0,2 оптической единицы, а отрицательного – не более 0,15. Все компоненты реакции вносятся по 100 мкл и разводятся в ФБСТ. Наивысшая активность антигена вируса КЛО достигнута при постановке ИФА, где в качестве твёрдой фазы использовались полистироловые планшеты зарубежных фирм из стран Финляндии, России, московского завода «Медполимер», Италии и США («Costar»), удовлетворительную активность показали полистироловые планшеты фирмы «Соstar». Оценку эффективности, специфичности и чувствительности метода ИФА для обнаружения антигена вируса КЛО проводили, исследуя вируссодержащие суспензии и культуральные специфические антигены данного вируса, где определяли их титр и возможные перекрестные реакции с антигенами вирусов гетерологичных возбудителей. Результаты этих исследований представлены в таблице 2

Как видно из результатов данной таблицы, разработанный нами метод ТФ-ИФА обладает высокой специфичностью и чувствительностью, так как во всех положительных пробах выявлен антиген вируса КЛО в титре от 1:32 до 1:320. В то же время все нормальные антигены и антигены вирусов гетерологичных возбудителей показали отрицательные результаты в ИФА.
Таблица 2 – Оценка эффективности, специфичности и чувствительности метода ТФ-ИФА для обнаружения антигена вируса КЛО


№ п/п

Наименование

проб


Результаты в ИФА

Специфические культуральные антигены вируса КЛО

1

АgS КЛО, очищенный с помощью ПЭГ- 6000

1:128 - 1:256

2

АgS КЛО, очищенный с помощью сернокислого аммония

1:256 - 1:320

3

ВСС КЛО, полученная на культуре клеток (VERO).

1:32 - 1:64

Антигены вирусов гетерологичных возбудителей

4

АgS вируса ОО

-

5

АgS вируса ОК

-

6

АgS вируса КЭО

-

Контроль (нормальные антигены)

7

20%-ная суспензия печени здоровой овцы

-

8

20%-ная суспензия легких здоровой овцы

-

9

20%-ная суспензия селезёнки здоровой птицы

-

10

АgN культур. (VERO)

-

Примечания:1. «-» - отрицательный результат. 2. «АgS» - антиген специфический. 3. «АgN» - антиген нормальный. 4. «ОО» - оспа овец. 5. «ОК» - оспа коз. 6. «КЭО» - контагиозная эктима овец.

Выводы

Таким образом, с использованием полученных препаратов разработан метод ИФА позволяющий выявлять группоспецифические антигены вируса блютанга в различных вируссодержащих материалах.


Литература


  1. Бакулов И.А., Котляров В.М. Мировая эпизоотическая ситуация по болезням диких животных// Материалы межд. науч.-практ. конф. 16-18 апр. 2002 г., г. Покров 2002

  2. Стрижаков А.А., Новикова М.Б., Стрижакова О.М. Гистохимический ИФА для обнаружения антигенов вируса блютанга // Материалы междунар. научно-практ. конф., ВНИИВВиМ, г. Покров, 1998г., С. 76.

  3. Теория и практика иммуноферментного анализа // Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. // М. Высшая школа. 1991. - С. 288.

  4. Мамадалиев С.М., Матвеева В.М., Кошеметов Ж.К. Применение метода ИФА для обнаружения антигена вируса чумы КРС. Материалы межд. научно-практ. конф., посв. 100-летию со дня рождения академика М.Н.Лущихина "Биотехнология в мире животных и растений" г. Бишкек. 2005 г. – Бишкек. 2005. С. 212-213.


  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   26


©netref.ru 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет