Изучение ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчине



жүктеу 0.77 Mb.
бет1/4
Дата03.05.2016
өлшемі0.77 Mb.
түріАвтореферат
  1   2   3   4
: content -> files -> pages -> folder299
pages -> Қр бғм білім және ғылым саласындағы бақылау Комитеті
pages -> Бағдарламасы Қазақ бөлімі «Тіл теориясы»
pages -> Дипломдық жұмыс тақырыптары № №ю№ Аты жөні Тақырыптары
pages -> БАҒдарламасы алматы 2012 Бағдарлама «050419 Музей ісі және ескерткіштерді қорғау»
pages -> АҚпараттық хат I фараби оқулары
pages -> БАҒдарламасы алматы 2012 Емтихан тақырыптарының тізімі
folder299 -> Абдраимова нуржан балтажановна ќытай мен Орталыќ Азия халыќтарыныѕ мјдени байланыстарыныѕ тарихы (VІІ-ХІІ єє.)
folder299 -> ТҰЯҚбаева айгүл бекайдарқызы германияның Орталық Азиядағы саясаты (1992-2009 жж.) Тарих ғылымдары саласында «халықаралық қатынастар»
folder299 -> Метрика вращающегося жидкого шара с учетом нелинейных по u и s 0 членов и сходимость разложений компонент метрического тензора
folder299 -> К проблеме расхождения релятивистских уравнений движения тел в ото


УДК 577.15; 581.19; 577.1; 581.133.1 На правах рукописи

КУДИЯРОВА ЖАНАР СЫРЛЫБАЙХАНОВНА

Изучение ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчине

Автореферат
диссертации на соискание академической степени доктора философии (Ph.D.) в области биологии по специальности «генетика»

Республика Казахстан

Алматы, 2009

Работа выполнена в Казахском национальном университете им. аль-Фараби.


Научные руководители: академик НАН РК,

доктор биологических наук,

профессор Гильманов М.К.,


доктор биологических наук,

профессор Ирель Б.


Рецензенты: доктор биологических наук,

Хайленко Н.А.,
доктор биологических наук,

профессор Сейтхожаев А.И.

Защита диссертации состоится «03» июня 2009 года на заседании Государственной аттестационной комиссии КазНУ им. аль-Фараби по адресу: 050040, г. Алматы, пр. аль-Фараби, 71, биологический факультет, ауд. 214.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке КазНУ им. аль-Фараби.


Автореферат разослан «___» мая 2009 года.

Секретарь ГАК С.Б. Даулетбаева



ВВЕДЕНИЕ
Общая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена исследованию ключевых ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом и устойчивостью генотипов злаковых культур к засолению и ржавчинным болезням.

Наиболее важные результаты были получены при изучении НАДФ-ГДГ-сферосом и ФК МДГ-ГОАТ. Было проведено комплексное исследование с привлечением ученых из ведущих научных центров Европы. Так часть работы по изучению регуляции НАДФ-ГДГ-сферосом выполнялось в Свободном Университете города Амстердам, (Нидерланды) под руководством профессора Альберта де Бура, а изучение активности ФК МДГ-ГОАТ у различных генотипов пшеницы проводилось в Международном Ротамстэдском Исследовательском центре Генетического улучшения зерновых культур, (Великобритания), под руководством профессоров Димы Хабаш и Найджела Халфорд.



Актуальность темы. Ключевые реакции обмена центральной аминокислоты азотного обмена - глютамата, являются одними из главных звеньев в метаболизме высших растений. Глютамат является донором аминогруппы для синтеза всех аминокислот злаковых культур. Так как процессы ассимиляции азота определяет белковую продуктивность то естественно, что изучение энзимологических механизмов функционирования обмена глютамата может открыть новые пути для управления процессами, которые определяют урожай злаковых культур.

За последние 35 лет роль ГДГ в метаболизме глютамата в растениях являются предметом продолжительной дискуссии (Oaks and Hirel, 1985; Dubois et. al., 2003; Terce Laforgue et. al., 2004). Известно, что в обеспечении нормального протекания процессов роста и развития растения очень большую роль играют ключевые ферменты метаболизма. Поэтому одной из цели нашего исследования явилось изучить роль центральных ферментов обмена глютамата в связи с морфогенезом важнейших злаковых культур, в первую очередь пшеницы. Неблагоприятные факторы внешней среды, такие как засоление, высокая температура, недостаток влаги, грибной патогенез, и другие оказывают отрицательное воздействие на рост и развитие растений. Засоление почв является одним из существенных факторов, ограничивающих продуктивность злаковых растений во многих агроклиматических зонах. Избыточные концентрации соли вызывают осмотический и оксидативный стрессы, а ионы хлора оказывают токсическии эффект. Растения реагируют на воздействие внешних стрессорных факторов изменением экспрессии генов, изменением интенсивности метаболизма, проницаемости клеточных мембран, баланса ионов в клетках и др. (Чиркова, 2002; Eimer, 2004; Кузнецов, Дмитриева, 2005; Ермакова и др., 2005).

Изучение ферментов азотного обмена в условиях засоления имеет очень важное значение для понимания процессов токсического действия солей на генотипы злаковых культур. Также и грибные болезни в мире ежегодно уничтожают 30-40% урожая злаковых культур. Если говорить о наиболее опасных заболеваниях грибной этиологии на зерновых, то, прежде всего это различные виды ржавчины: стеблевая, бурая и желтая.

Изучение ключевых ферментов обмена глютамата, в норме и при стрессовых условиях у важнейших злаковых культур Казахстана, открывают новые пути для управления процессами, которые определяют, в конечном счете, биологическую продуктивность, его качество, и устойчивость растений к стрессовым условиям, таким как засоление и ржавчинные заболевания.



Цель, объекты, предмет и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование ключевых ферментов обмена глютамата, их активности в ходе онтогенеза пшеницы и у сортов и генотипов злаковых культур, различающихся по устойчивости к засолению, высокой температуре и ржавчине.

Объектами исследования являлись различные сорта и генотипы пшеницы (Triticum aestivum L.), (Triticum durum Desf.), ячменя (Hordeum vulgare L.), риса (Oriza sativa L.) и кукурузы (Zea maize L.).

Предметами исследования являются семена злаковых культур и листья, стебли, корни, колосковые чешуйки, пшеницы.

Для достижения поставленной цели, нами решались следующие задачи:

-выяснить механизмы активации НАДФ-ГДГ-сферосом при прорастании и созревании семян пшеницы;

-получить гомогенные препараты ФК МДГ-ГОАТ из семян пшеницы и определить его полипептидный состав;

-выявить активность ФК МДГ-ГОАТ у организмов, различающихся в эволюционном плане;

-установить роль активности ФК МДГ-ГОАТ в онтогенезе злаковых культур.

-исследовать активность ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы, ячменя и риса, различающихся по устойчивости к засолению и у сортов пшеницы, различающихся по устойчивости к ржавчине.

Научная новизна работы:

-физико-химическими методами был установлен механизм активация НАДФ-ГДГ-сферосом при прорастании и созревании зерна пшеницы. Установлена КМ НАДФ-ГДГ сферосом равная 1 мкМ, что говорит об очень важной роли этого фермента в ассимиляции азота;

-получен гомогенный препарат ФК из покоящегося зерна пшеницы, который состоит из двух полипептидов с массой 60 кДа и 50 кДа, что свидетельствует о том, что ФК кодируется двумя сопряженными генами, геном малатдегидрогеназы и геном глютаматаоксалоацетатаминотрансферазы;

-установлено, что ФК является эволюционно молодым белковым комплексом, он имеется только у эволюционно молодых растений;

-выявлена активность ФК МДГ-ГОАТ в онтогенезе злаковых культур;

-определены активности ФК МДГ-ГОАТ у сортов пшеницы, ячменя и риса, различающихся по устойчивости к засолению и у сортов пшеницы, различающихся по устойчивости к ржавчине.



Основные положения, выносимые на защиту:

-под воздействием фузикокцина активируется протонная АТФ-аза, осуществляющая транспорт ионов кальция в цитоплазму алейроновых клеток зерна пшеницы. Затем ионы кальция совместно с низкомолекулярным регулятором, вызывают активацию фосфокиназы «С», которая в свою очередь приводит к активации строго НАДФ специфичной ГДГ-сферосом;

-гомогенные препараты ФК из покоящегося зерна пшеницы состоят из двух полипептидов с массой 60 кДа и 50 кДа, что свидетельствует о том, что ФК кодируется двумя сопряженными генами, геном малатдегидрогеназы и геном глютаматаоксалоацетатаминотрансферазы;

-ФК отсутствует у микроорганизмов, в водорослях, низших растениях и эволюционно древних высших растениях и является эволюционно молодым белковым комплексом, который имеется у эволюционно молодых растений;

-активность ФК играет очень важную роль при прорастании и созревании зерна пшеницы – важнейшие этапы морфогенеза злаковых культур;

-устойчивые генотипы злаковых культур активируют ФК в ответ на засоление, и к ржавчине, тогда как неустойчивые к засолению генотипы не обладают такой способностью.



Методы исследований. В ходе исследовании были применены следующие методы: хроматографии, спектрофотометрии, SDS-электрофореза, электронной микроскопии, и масспектрометрии. Были разработаны и применены методы изучения НАДФ-ГДГ-сферосом, очистки регулятора и ФК МДГ-ГОАТ, и методика определения активности АТФ-азы плазматических мембран из алейроновых слоев семян пшеницы.

Все результаты, полученные в ходе исследовании, были обработаны и проанализированы с помощью компьютерных программ, а для их интерпретации и обсуждения использовались литературные источники из отечественной и зарубежной литературы, периодики, Интернет порталы, сайты и др.



Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы получили апробацию на следующих международных научных форумах таких как: Международной биохимической конференции (Ташкент, 2006г.); на Конгрессах Федерации европейских биохимических обществ (ФЕБО): 31-ом, конгрессе (Стамбул, 2006); 32-ом конгрессе (Вена, 2007); 33-ем конгрессе (Афины, 2008); Международном симпозиуме «Азот-2007» (Ланкастер, 2007); во 2-ом Международном симпозиуме «Ростовые вещества растений: внутриклеточные гормональные механизмы и их применение в агрономии» (Киев, 2007); V-ой Международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2007); Всемирном конгрессе Науки, Инжиниринга и Технологии (Венеция, 2007); а также в семи научно- практических и международных конференциях Казахстана таких как: IV Международных научных конференциях молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии» (Алматы, 2006, 2008); Международный Конгресс студентов и молодых ученых, «Мир науки» Казахстанские химические дни-2007 (Алматы, 2007); Труды V международной научно-практической конференции, «Социально-гуманитарные проблемы современного образования», (Талдыкорган, 2007); «Қазақстаннын биологиялық қауіпсіздігін қамтамасыз ету мәселелері», ЕМК «Ботаника және фитоинтродукция Институты», (Алматы, 2008); Международной научно-практической конференции «Биоразнообразиe и устойчивое развитие природы и общества», посвященная 75-летию КазНУ им. аль-Фараби и 75-летию биологического факультета.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты настоящей диссертационной работы в значительной степени расширяют теоретические представления об основных ферментах обмена глютамата, и о процессах которые определяют белковую продуктивность злаковых культур.

На основе полученных результатов предлагается применить активность ФК для отбора жизнеспособных семян злаковых культур. Активность ФК в определенной степени может служить маркерным признаком устойчивости генотипов пшеницы и ячменя к засолению, высокой температуре и ржавчинным болезням.



Объем и структура работы. Диссертация состоит из обозначений и сокращений, введения, обзора литературы, раздела, описывающего материалы и методы исследований, содержащих результаты исследований и их обсуждения, заключения и списка использованных источников из 168 наименований. Текст изложен на 93 страницах. Работа проиллюстрирована 18 рисунками и 15 таблицами.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Выбор направления исследований

Ключевые ферментативные реакции процессов ассимиляции азота и обмена центральной аминокислоты азотного обмена - глютамата, являются одними из главных звеньев в метаболизме высших растений. Именно глютамат является донором аминогруппы для синтеза всех аминокислот. Глютамат также является той аминокислотой, которой аккумулируется минеральный азот. В ходе онтогенеза обмен глютамата претерпевает ряд существенных морфогенетических изменений, и их познание открывает пути для управления процессами, которые определяют продуктивность злаковых культур. Поэтому целью настоящего исследования является познание основных этапов функционирования обмена глютамата. Изучение ключевых ферментов, осуществляющих реакции обмена глютамата в норме и при стрессовых условиях у важнейших злаковых культур Казахстана, открывают новые пути для управления процессами, которые определяют, в конечном счете, биологическую продуктивность, его качество, и устойчивость растений к стрессовым условиям, таким как засоление и ржавчинные заболевания.

В обзоре литературы приводятся сведения, отражающие состояние изучаемой проблемы, ее актуальность и современный взгляд ученых всего мира на энзимологические механизмы азотного обмена и новые научные подходы их изучения на молекулярно – генетическом уровне.

Метод изучения НАДФ-ГДГ-сферосом

Схема очистки сферосомы включала: растирание на холоду в фарфоровой ступке в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,8, взятого в четырехкратном объеме (мл) по отношению к навеске чешуй (г). Гомогенат центрифугировали при 10000g в течение 10 мин. Осадок отбрасывали, а в бесклеточный экстракт для осаждения нуклеиновых кислот и хлорофилла добавляли стрептомицин сульфат в соотношении 1:5. Через 2 часа экстракт центрифугировали 10 мин при 8000g для осаждения зеленых пигментов, нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Супернатант пропускали через колонку с сефадексом G-50 для освобождения стрептомицин сульфата и низкомолекулярных соединений. После чего проводили ионообменную хроматографию на DEAE целлюлозе, типа DE-52, фирмы "Watman", (Великобритания).

В качестве заключительной стадии очистки применяли аффинную хроматографию на 2,5 ADP-сефарозе, фирмы Pharmacia (Швеция). Эта стадия очистки позволяла полностью очистить НАДФ-ГДГ от примесей НАД-ГДГ. Имея гомогенные препараты НАДФ-ГДГ, мы смогли перейти к изучению очень важного вопроса определения субъединичного состава этого фермента. С этой целью очищенный препарат НАДФ-ГДГ кипятили 5 минут в 0.05М трис-глициновом буфере, рН-8.3, в присутствии 0,1% 2-меркапто-этанола и 0.1% SDS, после чего смесь подвергали SDS- электрофорезу в ПААГ по Laemmli (1970) [161]. Активность глютаматдегидрогеназы определяли по реакции восстановительного аминирования 2-оксоглютарата по изменению адсорбции при длине волны 340 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, Amersham-Bioscience. Для проведения реакции брали реакционную смесь следующего состава: 0,0002 М НАДН, 0,02 М 2-оксоглютарата и 0,225 М NH4CI. Объем реакционной смеси доводили 0,1 М трис-HCI буфером рН 8,3 до 2 мл.

Скорость ферментативной реакции определяли изменением за 1 мин. Удельную активность рассчитывали в мкМ окисленного НАДН на 1 мг белка.


Метод очистки регулятора

Схема очистки регулятора включала следующие стадии: гомогенизацию, центрифугирование, гидрофобную хромотографию на колонке с октилсефарозой CL- 4B и обратно-фазовую хроматографию на колонке типа RP18. Для очистки брали 2 кг семян пшеницы сорта «Арай», которые замачивали в водопроводной воде содержащей 1 мМ СаCl2 и 0,1 мМ 6-БАП, который необходим для активации образования регулятора в зародышах прорастающих семян пшеницы. Спустя сутки семена трехкратно промывали дистиллированной водой, после чего просушивали их под вентилятором от остатков влаги и затем семена гомогенизировали на ножевом гомогенизаторе типа MPW-309 Mechanika Precyzyina (Польша) в 4 литрах 70% этанола. Гомогенат фильтровали через капроновую ткань, и фильтрат центрифугировали в течение 10 минут при 10000 х g. Супернатант наносили на колонку с октилсефарозой CL- 4B. Гидрофобная хроматография спиртового экстракта из проросших семян пшеницы сорта «Арай» на колонке с октилсефарозой CL-4B. Размер колонки 3,5х20 см. Колонку уравновешивали 10 % этанолом. Отмывку от не связавшихся веществ проводили 10%-ным этанолом. Регулятор смывали элюцией 50% этанолом, после чего колонку промывали 80% этанолом для освобождения колонки от адсорбированных на ней веществ. Затем пик содержащий регулятор подвергали обратно-фазовой хроматографии на колонке типа RP18.


Методика определения активности АТФ-азы плазматических мембран из семян пшеницы

Целые семена пшеницы замачивали в растворе регулятора и через 2 часа отрезали зародышевые части зерна, которые растирали в трис–НCl буфере, pH-7,4. Гомогенат центрифугировали и полученный бесклеточный экстракт содержащий 14-3-3 белки использовали для опыта. Спектрофотометрическое определение Н+-АТФ-азной активности проводили таким образом: к 0,2 мл полученного супернатанта приливалось 1,7 мл 0,025М трис-НCl, pH-8,0. Инкубировали в течении 30 минут при 25˚С и добавлялось 0,1 мл Са2+ и Mg2+ с конечными концентрациями в пробирке 0,003М. В контрольные пробирки вносили по 1 мл 20% ТХУ. Затем пробирки оставляли на 1 час в термостате при 25˚С после чего для прекращения реакции в опытную пробирку добавляют по 1мл 20% ТХУ. Содержимое пробирок фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат использовали для определения фосфора. Для этого к 0,2мл фильтрата добавляем 0,2мл железно-молибдатного реактива и 1,6мл трис-НCl буфера, pH-8,0. Инкубируем 15 минут, и замеряли поглощение при 660нм.


Спектрофотометрический метод определения активности ферментного комплекса (ФК МДГ-ГОАТ)

Нами впервые был разработан спектрофотометрический метод определения активности ФК МДГ-ГОАТ. Реакционная смесь для определения ФК содержала 1,1мМ NAD, 12мМ малата и 87мМ глутамата натрия и реакционная смесь доводилась до объема 2 мл 0,05М трис-глициновым буфером, рН 7,7. Процедура определения активности ФК имеет свои особенности. Сначала мы в течение 1-2 минут определяли базовую активность малатдегидрогеназы. Для этого реакционная смесь содержала все ингредиенты кроме глутамата, и только после определения базовой активности добавляется глутамат. Активность ФК определяется по приросту активности после добавления глутамата. Для определения активности от конечной активности отнимали активность МДГ. Активности обеих реакции рассчитывали по изменениям адсорбции за одну минуту. Также необходимо было провести спектрофотометрическое определение активности ГДГ в реакции восстановительного аминирования. Для определения активности ФК теперь необходимо вычесть активность ГДГ в реакции окислительного дезаминирования глютамата. Для этого полученную активность ГДГ делим на 12, так как для этого фермента характерно постоянное соотношение скоростей прямой и обратной реакции равное 1/12. В результате, чистая активность ФК определяется путем определения полной активности в реакционной смеси с вычетом активности МДГ и ГДГ.

Так, как описание методов выделения и очистки ФК из изучаемых объектов относится к результативной части, то их описания будут приведены в главе «Результаты исследования и их обсуждение».

Концентрацию белка определяли микробиуретовым методом по Бэйли (1965) при длине волны 330 нм на спектрофотометре типа Ultraspec-1100, Amersham-Bioscience и по методу Брэдфорда.

Все опыты проводились в 6-7 кратной повторности, и в таблицах приводится данные наиболее типичного из опытов. Все результаты были подвергнуты стандартной статистической обработке.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГДГ сферосом и её регуляция

В Институте Молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина в лаборатории структуры и регуляции ферментов впервые было изучено строение и функция сферосом неизученных органелл растительной клетки. Впервые было установлено, что сферосомы на 70% - тов состоит из ГДГ и 30% из одного фосфолипида- фосфатидилинозитола (ФИ). Нами было проведено изучение регуляции ГДГ сферосом при прорастании и созревании семян пшеницы и других злаковых культур. В основе разработанного метода лежит метод описанный Р. Дильбаркановой и М.К. Гильмановым.

Так как, белковый компонент сферосомы составляет более 2/3 от массы сферосомы, то необходимо было более детально изучить его. С этой целью белковый компонент сферосомы был подвергнут SDS–электрофорезу по Laemmli (1970). Для разделения был использован плоский 12% полиакриламидный гель. Окраску белковых зон проводили красителем Кумасси Blue R-250.

Было установлено, что в составе сферосомы имеется лишь 1 полипептид с молекулярной массой 52 кДа. Эти результаты еще раз подтвердили наличие в сферосоме лишь одного белка – глютаматдегидрогеназы. Нами было сделано лишь уточнение молекулярной массы субъединиц этого белка, которое оказалось равным 52 кДа.

Ковалентно присоединенный к ГДГ фосфатидилинозитол выполняет роль своеобразного якоря. Благодаря наличию этого «якоря» в своем составе ГДГ заякоривается только на фосфатидилинозитольных мембранах вследствие полного стерического соответствия фосфатидилинозитолам мембраны. При встрече молекулы глютаматдегидрогеназы с фосфатидилинозитольной везикулой происходит погружение гидрофобных диацильных хвостов «якоря» ГДГ в фосфатидилинозитольную мембрану и якорь прочно удерживается в мембране благодаря гидрофобному взаимодействию между близко стоящими диацильными хвостами фосфолипидов мембраны. Белок ГДГ ковалентно соединен с «якорем» через длинную гибкую гликановую цепочку, благодаря чему фермент имеет определенную подвижность. В конечном счете, многочисленные молекулы ГДГ полностью покрывают толстым слоем всю поверхность сферосомы.

Большой интерес представляет изучение воздействия ионов кальция на активность ГДГ сферосомы. Для этого были поставлены следующие опыты. К препарату высокоочищенных сферосом добавляли 1/10 от объема сферосом раствор 10 mM CaCl2 и через 30 минут инкубации сферосомы освобождали от не связавшихся ионов кальция гель-хроматографией на колонке с Сефадексом G-50. Явилось интересным изучить, влияют ли ионы кальция на структуру сферосом. Для этого применили метод электронной микроскопии.

Действие ионов кальция приводит к сильному изменению структуры сферосомы – появлению в белковой оболочке ряда своеобразных отверстий. Естественно, что такое сильное изменение структуры сферосом связано с соединением ионов кальция с сайтами EF-hand loop motifов в ГДГ сферосом.

Нами показано, что интактные сферосомы (на которые ионы кальция не действовали) не проявляют никакой ГДГ активности.

Было проведено изучение активности ГДГ сферосом после действия ионов кальция. Проведенные нами прямые замеры активности глютаматдегидрогеназы после воздействия ионов кальция на сферосомы, показали равные как с НАДН так и с НАДФН в качестве кофермента активности глютаматдегидрогеназы равной 10 мкМ на мг белка, в мин.

Теперь встал вопрос о том, что раз ГДГ регулирется ионами кальция, то необходимо было найти регулятор который увеличивает концентрацию ионов кальция в цитоплазме.

Б.Е. Султанбаевым с соавторами впервые было установлено, что в прорастающих зародышах пшеницы под воздействием цитокинина образуется регулятор, который увеличивает содержание ионов кальция в цитоплазме.

Так как свойства этого регулятора не были изучены, то возникла острая необходимость их изучения. Для изучения регулятора необходимо было разработать эффективный метод его очистки. За основу метода очистки регулятора был принят метод Б.Е. Султанбаева. Главной особенностью разработанного нами метода является то, что мы впервые для более высокой очистки регулятора, применили метод обратно-фазовой хроматографии на колонке типа RP18, что позволило получить гомогенный препарат регулятора незагрязненный другими фитогормонами.

При обратно-фазовой хроматографии регулятор элюировался в первом пике. В результате нами был получен высокоочищенный препарат регулятора.

Имея гомогенный препарат регулятора, нами была изучена его структура. Структура регулятора была установлена методом масспектрометрии на масспектрометре марки Agilent 1100 с ионной ловушкой типа Esquire 3000 plus (США). Анализ был проведен в Институте Биомедицинской Химии им. В.Н. Ореховича. Было установлено, что по своему масс-спектру регулятор является фузикокцином.

Как ранее было установлено, что в беззародышевой части зерна в алейроновом слое находится сферосома. Мы изучили действие фузикокцина на беззародышевые половинки сухих семян зерна пшеницы сорта «Стекловидная- 24». Как показал опыт фузикокцин не вызывал появление НАДФ-ГДГ сферосом. Для установления причины этого мы изучили литературу по фузикокцину.

Из данных литературы известно, что фузикокцин осуществляет активацию ионного транспорта только вместе с 14-3-3 белками. Известно, что фузикокцин активирует Н+-АТФ-азу плазматических мембран клеток растении. Для изучения свойств нового природного биорегулятора - мы решили испытать его действие на АТФ-азную активность плазматических мембран из алейроновых клеток семян пшеницы.

Было установлено, что регулятор не активировал АТФ-азу плазматических мембран алейроновых клеток, когда он действовал на изолированные беззародышевые части зерна пшеницы. В то же время активация АТФ-азы имело место, если регулятор действовал на целое зерно. Это говорит о том, что регулятор в зародышах семян пшеницы индуцировало синтез другого регулятора. Таким регулятором является, скорее всего, 14-3-3 белки, которые необходимы для действия фузикокцина. Для выделения этих белков из зародышевой части семян пшеницы мы провели следующий опыт.

Целые семена пшеницы замачивали в растворе регулятора и через 2 часа отрезали зародышевые части зерна, которые растирали в трис–НCl буфере, pH-7,4. Гомогенат центрифугировали и полученный бесклеточный экстракт, содержащий 14-3-3 белки использовали для опыта.

Обработка этим препаратом беззародышевых частей зерна не приводило к активации АТФ-азы. Это говорит о том, что 14-3-3 белки сами по себе не могут активировать АТФ-азу. Активация достигалось лишь тогда, когда этот препарат действовал совместно с регулятором. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Влияние регулятора на активность АТФ-азы плазматических мембран из беззародышевой части семян и из целого зерна пшеницы


Варианты

Активность АТФ- азы плазматических мембран с ионами Mg2+

мкМ Pi /мг белка



Активность АТФ- азы плазматических мембран с ионами Ca2+

мкМ Pi /мг белка



без регулятора

с регулятором

без регулятора

с регулятором

Беззародышевые части

180 ± 21

250 ± 55

140 ± 26

280 ± 53

Целое зерно

200 ± 36

-

160 ± 41

400 ± 32

Таким образом, активация АТФ–азы осуществляется регулятором совместно с 14-3-3 белками. Была изучена катионная специфичность активируемой АТФ-азой и было установлено, что она является Са2+ зависимым ферментом.

Катионная специфичность активированного регулятора и 14-3-3 белками АТФ-азы говорит о том, что именно этот фермент повышает уровень цитозольного кальция в клетке.

Таким образом, мы предположили, что фузикокцин действуя на прорастающий зародыш в злаках, вызывает образования в нем 14-3-3 белков или их аналогов. Только затем они, действуя совместно на алейроновый слой, вызывает в нем активацию НАДФ-ГДГ сферосом. Для проверки нашего предположения был поставлен следующий опыт. Был получен раствор нашего фузикокцина в концентрации 20 ng/ml. В этом растворе были замочены целые семена пшеницы и через 24 часа у проросших семян пшеницы были удалены зародышевые части, и из беззародышевых половинок семян была выделена фракция сферосом, гель - хроматографией на колонке с сефарозой 4В. Изучение ГДГ активности выделенных сферосом показала, что она имеет высокую НАДФН-ГДГ активность (около 50мкМ НАДФ на мг белка в минуту). В то же время выделенная фракция сферосом не проявляла никакой НАДH активности.

Таким образом, становится совершенно ясным, что активация НАДФ-ГДГ сферосом алейронового слоя семян злаков регулируется фузикокцином и каким-то другим низкомолекулярным регулятором вероятнее всего 14-3-3 белками. Так как, наше исследование не является биохимическим, то решение вопроса о природе этого регулятора не входила в задачи этого исследования.

Очень важным явилось изучить особенности сферосом выделенных из активно ассимилирующих органов. Наиболее ассимилирующим органом растений являются созревающие семена растений. Поэтому мы решили выделить сферосомы из семян пшеницы и кукурузы в фазу их молочно- восковой спелости.

Для выделения сферосом мы впервые применили новый метод очистки с использованием нового наноструктурированного углеродного сорбента типа нанокарбосорб, который был разработан под руководством профессора З.А. Мансурова в Институте проблем горения при КазНУ им. аль-Фараби.

Было установлено, что сферосомы выделенные из созревающих семян из пшеницы и кукурузы имеют высокую НАДФН-ГДГ активность и не проявляли никакой НАДH-ГДГ активности. Было определено константы Михаэлиса к ионам аммония выделенных сферосом.

Установлено, что Км для ионов аммония НАДФН-ГДГ сферосом из созревающих семян пшеницы и кукурузы был равен около 1 мкМ ионов аммония. Это говорит об очень высоком сродстве к ионам аммония НАДФН - ГДГ сферосом из выделенных из созревающих семян злаков. Таким образом, получены неопровержимые доказательства участия НАДФН - ГДГ сферосом в ассимиляции аммония в созревающих семенах злаков.

Так как, в активации НАДФН - ГДГ играют большую роль протеинкиназа «С» мы решили проверить, как проявиться дефосфорилирование ГДГ сферосом выделенных из созревающих семян злаков на их НАДФН и НАДН активности. Для этого мы воздействовали на выделенные НАДФН-ГДГ сферосомы пшеницы и кукурузы препаратом щелочной фосфатазой из кишечника цыпленка. (Фирма Sigma, США). После дефосфорилирования активность НАДФН-ГДГ снизилась два раза и появилась равная ей НАДН-ГДГ активность. То есть, это активности, которые возникают при активации латентной ГДГ–сферосом ионами кальция.

Таким образом, мы можем предположить, что в созревающих колосьях пшеницы и в созревающих початках кукурузы под воздействием цитокинина сначала происходит образование фузикокцина, затем под воздействием фузикокцина образуется 14-3-3 белки или их аналоги. После совместного воздействия фузикокцина и 14-3-3 белков увеличивается уровень ионов кальция в цитоплазме и активируется фосфокиназа «С», что приводит к активации НАДФН-ГДГ сферосом в созревающих семенах злаковых культур. Именно этот фермент играет главную роль в ассимиляции минерального азота в созревающих семенах злаковых культур в самый ответственный момент морфогенеза растений. Путь ассимиляции азота через НАДФН–ГДГ сферосом является наиболее экономичным и простым, по сравнению с путем через систему ГС-ГОГАТ. Для ассимиляции аммония через оксоглютарат требуется лишь один эквивалент НАДФН, который легко синтезируется при фотосинтезе зеленых в колосьях злаков. В то же время для ассимиляции аммония через систему ГС-ГОГАТ требуется один эквивалент НАДН и один эквивалент АТФ. А эти энергетические кофакторы образуются лишь при дыхании, которое идет в ночное время. О преимуществе пути ассимиляции неорганического азота через путь, катализируемый, НАДФН-ГДГ сферосом говорит простой, но очень эффективный опыт профессора А.Н. Павлова. Он затемнял созревающие колосья пшеницы, но оставлял незатемненными листья и стебли, в которых сосредоточен основной фотосинтетический аппарат растения. Самым удивительным оказалось, то, что при затемнении созревающих колосьев уменьшало более чем в два раза содержание белка в созревших семенах. Этот опыт говорит о важной роли фотосинтеза именно колосьев для накопления белка.

Этим же ученым была установлена связь между содержанием цитокининов в колосьях и продуктивностью сортов пшеницы. То есть, было установлено, что имеется прямая корреляция между содержанием цитокинина и продуктивностью различных генотипов пшеницы. Наши исследования теперь непосредственно впервые проливают свет на связь цитокининов с белковой продуктивностью злаковых культур.

Таким образом, очень важный процесс ассимиляции азота в созревающих семенах злаковых культур находится под прямым контролем цитокинина, одного из важнейших фитогормона растений. Известно, что цитокинин играет исключительно важную роль в процессах морфогенеза растений. Таким образом, активность НАДФН–ГДГ-сферосом является очень важной для формирования семян растений.

Так как НАДФ-ГДГ связано со сферосомами, а сферосомы имеются только в семенах то естественно, что НАДФ–ГДГ играет ключевую роль только при прорастании и созревании семян. Поэтому НАДФ-ГДГ не был обнаружен в других органах растения.

Таким образом, можно придти к заключению о том, что НАДФН-ГДГ-сферосом играет важную роль в ассимиляции минерального азота в наиболее важные этапы морфогенеза растении - при прорастании и созреваний семян злаков и её активность очень важна для формирования белковой продуктивности.



  1   2   3   4


©netref.ru 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет