Мусабеков Айдос Туменбаевич Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков



жүктеу 167.79 Kb.
Дата25.04.2016
өлшемі167.79 Kb.
түріДиссертация
: downloads -> doctorantura
doctorantura -> Қазақстан республикасы Білім және ғылым министрлігі
doctorantura -> Сұрақтардың тақырыптары Сызықтық автоматты басқару жүйесінің теориясы
doctorantura -> «Экологические особенности агрофитоценоза сои при ресурсосберегающей технологии выращивания на юго-востоке Казахстана»
doctorantura -> Мазмұндама омарова айнұр тұЯҚҚызы қазақстанның индустриалдық-инновациялық даму жағдайында адам ресуртарын басқару
doctorantura -> БАҒдарламасы мамандық бойынша емтихан : «6D070400- есептеу техникасы және бағдарламалық қамтамасыз ету»
doctorantura -> 6D020500 – «Аударма ісі» мамандығы бойынша PhD докторантураға қабылдау емтиханының сұрақтары
doctorantura -> Сәулет құрылыс факультеті 6М042100-«Дизайн»
doctorantura -> Ілгерілемелі және айналмалы қозғалыстағы материалдық нүктенің динамикасы
doctorantura -> «25» тамыз 2014 ж. №1145-п бұйрыққа №6 қосымша
doctorantura -> Даулбаевой Альмиры Нурлановны Динамика изменения концентрации основных загрязняющих веществ в приземном слое атмосферы города Алматы Структура и объем диссертации диссертация
Мусабеков Айдос Туменбаевич
Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации

спермы хряков
АННОТАЦИЯ
диссертации на соискание ученой степени доктора философии (PhD)

по специальности 6D070100 – Биотехнология


Общее описание работы. Диссертация по уровню принадлежит к научно-техническим разработкам имеющих ценность к животноводству, в частности свиноводству, теоретические и практические выводы будут интересны ученым работающим с криобиологией клеток.

Актуальность темы диссертационного исследования. Открытие витрификации сыграло чрезвычайно большую роль в разработке методов низкотемпературной консервации спермы, так как некристаллическое замерзание мало повреж­дает клетки и сохраняет их жизнеспособность. Однако оно про­исходит лишь при очень высоких скоростях охлаждения, по­рядка 5000°С/с, что практически не достижимо. Кроме того, было показано, что стекловидное состояние неустойчиво: начи­ная с температуры -100°С происходят образование и укруп­нение кристаллов. Это явление называют рекристаллизацией при оттаивании, или миграционной кристаллизацией. Рекри­сталлизация губительна для половых клеток самцов. Стекловидное состояние можно сохранить при температуре ниже -130 °С. Это обстоя­тельство побудило ученых обратиться к поиску защитных ве­ществ, которые бы способствовали некристаллическому замер­занию.

Теоретические исследования в криобиологии спермы животных открыли большие перспективные возможности не только в ускоренном развитии и широком внедрении методов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, но и в сохранении генетически наиболее ценных и исчезающих пород и видов животных.

Успешная разработка методов низкотемпературной консервации спермы животных невозможна без глубокого познании причин и механизмов повреждения и устойчивости спермы при охлаждении и замерзании. Известно, что в процессах клеточного дыхания, реакциях окислительного фосфорилирования важную роль играют низкомолекулярные тиоловые соединения, содержащие сульфгидрильные группы (SН-). Они входят в активные центры многих ферментов и коферментов, а также участвуют в поддержании третичной структуры белков клеток.

В свиноводстве страны методы искусственного осеменения применяют только лишь в нескольких хозяйствах, а разработкой технологии криоконсервировации эякулятов вообще не занимаются. Это связано с биологическими особенностями низкой криоустойчивости спермы хряков, необходимостью замораживания значительно больших объемов спермы, технологическими и методическими трудностями с нестабильностью результатов осеменения. Поэтому проблема совершенствования метода криоконсервации спермы хряков и поиск подходов и способов повышения криоустойчивости сперматозоидов остается весьма актуальной.

На современном этапе развитии искусственного осеменения в свиноводстве актуальны изучения изменении количества сульфгидрильных групп в плазме спермы и сперматозоидов хряков при охлаждении и замораживании-оттаивании, выявление между содержанием SН-групп в свежеполученной сперме и функциональной полноценностью заморожено-оттаянной спермы, а также поиски путей повышения криоустойчивости эякулятов хряков. В связи с этим разработка сред с использованием тиоловых соединений для кратковременного и долговременного хранения спермы имеет научную ценность, а полученные результаты являются инновационными.

Решение биотехнологической проблемы по дальнейшему совершенствованию кратковременного и долговременного хранения спермы хряков приведет к использованию высокоценных, оцененных по селекционно-генетическим параметрам хряков-производителей, избежать близкородственного спаривания, повышению воспроизводительных качеств свиноматок, увеличению темпа роста молодняка свиней, а также более широкого внедрения прогрессивного метода - искусственного осеменения маточного поголовья.



Цель исследований является разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков, путем изучения взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп и качеством эякулятов, влияние добавленного тиолового соединение на сохранности функциональных показателей при кратковременном хранении и криоустойчивости замороженно-оттаянной спермы. Для достижения поставленной цели диссертационного исследования решались следующие задачи:

    1. Исследование количественных показателей сульфгидрильных групп в плазме эякулята и сперматозоидах и их влияния на качественные показатели спермы;

    2. Исследование влияния серосодержащих и тиоловых соединений на изменение окислительного фосфорилирования в сперматозоидах и качественные показатели свежеполученных и замороженных эякулятов;

    3. Исследование влияния серосодержащих и тиоловых реагентов на дегидрогеназную и цитохромоксидазную активность спермы;

    4. Исследование влияния охлаждения и замораживания-оттаивания на общую активность и изоферментный спектр фермента лактатдегидрогеназы;

    5. Определение эффективности использования высокоценных хряков-производителей с новыми разработанными средами для хранения спермы в условиях кратковременного (+ 2 – 0 0С) и долговремененного хранения (-196 0С);

    5. Определение параметров сохранности качественных показателей сперматозоидов после хранения с новыми разбавителями в производственных условиях;

    7. Определение экономической эффективности применения разработанных новых сред для спермы хряков-производителей.


Объектом исследования являются свиньи крупной породы в свиноводческих хозяйствах «Достык», «Дидар» и «Аксункар» Южно-Казахстанской области. Ряд анализов проведены в специализированных лабораториях Всероссийского НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных – Россия; в лабораториях Южно-Казахстанского государственного университета имени М. Ауезова.

Методы исследования. Качество эякулята оценивали по цвету, запаху, объему, концентрации, активности и абсолютному показателю переживаемости по общепринятым методикам и в соответствии с ГОСТ 20909.4. Определение подвижности спермиев и ГОСТ 20909.4. Концентрацию сперматозоидов определяли в камере Горяева и выражали в млрд. на 1 мл спермы. Активность (процент поступательно-активных клеток) определяли микроскопированием капли семени при температуре 38...40С и выражали в баллах от 1 до 10, что соответствует 10-100 процента.

Криоконсервацию спермы проводили на фторопластовой пластине в парах жидкого азота при температуре на пластине -85С. Оттаивали замороженную сперму с помощью гидрооттаивателя конструкции ВИЖа.



Научная новизна исследования. Впервые в практике технологии искусственного осеменения свиней изучены влияние низкомолекулярных тиоловых соединений на качественные показатели спермы хряков-производителей. Выявлены ряд новых, принципиально важных закономерностей, позволяющих существенным образом расширить и углубить теоретические и практические основы воспроизводства животных.

Впервые показана возможность повышения криоустойчивости сперматозоидов введением в среду криоконсервации низких концентраций веществ со специфическим и неспецифическим действием (низкомолекулярные SH-соединения, мочевина).

Определены параметры взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп (SН-) спермы и ее качественными показателями.

Разработаны новые среды кратковременного хранения (+2-00С) глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (ГЦДУ) и долговремененного хранения глюкозо-цитратно-глицерино-дитиотреитоло-унитиоло-мочевино-желточная (ГЦДУМЖ) (-1960С). Применение разработанных сред позволить повысить эффективность использования высокоценных хряков-производителей.



Научно-практическая значимость работы. Результаты экспериментальных исследований позволили расширить понимание молекулярных механизмов криоповреждений и криозащиты клеточных структур, определить способы и направление повышения криоустойчивости к повреждающему действию низких температур. Введение в состав среды криоконсервации унитиола и дитиотреитола увеличило результативность криоконсервации сперматозоидов хряка, а предложенный способ концентрирования спермы уменьшил потребность в хладагенте и емкостях для хранения замороженной спермы. Разработаны и представлены для внедрения:

- использования содержания сульфгидрильных групп для оценки качественных показателей и криоустойчивости спермы хряков;

- новая среда для кратковременного хранения, под условным названием глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (ГЦДУ);

- новая среда для криоконсервации спермы под условным названием глюкозо-хелато-цитратно-глицерино-дитиотреитоло-унитиоло-желточная (ГХЦДУЖ);



Апробация работы. Основные положения диссертации отражены в 23 публикациях, в том числе в 4 изданиях, включенных в перечень Комитета по контролю в сфере образования и науки Республики Казахстан. 1 статья была опубликована в международных научных изданиях, входящих в базу данных Thomson Reuters. Результаты исследований докладывались на научных конференциях: «Повышение продуктивных качеств сеьскохозиственных животных» (Санкт-Петербург 2010), «Стратегические вопросы мировой науки» (Przemysl 2011), «Перспективные научные исследования» (София 2011), «Наука и технологии: шаг в будущее» (Прага 2011), «Повышение интенсивности и конкурентноспособности отраслей животноводства» (Жадино 2011), «Астана Биотех 2011» (Астана 2011) «2nd International Conference on Agricultural and Animal Science» (Maldives 2011). Результаты работы опубликованы также в научных журналах «Зооветеринария» (Ташкент 2010, 2011) «Научный вестник Южного региона» (Шымкент 2011), «Современный научный вестник» (Белгород 2011), «Приднепровский научный вестник» (Днепропетровск 2011), «Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук» (Москва 2012).

Основные результаты:

- определены параметры взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп (SН-) спермы хряков и ее качественными показателями.

- теоретически обоснованы и практитчески решены способы защиты сульфгидрильных групп спермы хряков с помощью тиоловых соединений и серосодержащих реагентов, вскрыты механизмы защиты спермы при их кратковременном хранении, криоконсервации и оттаивании.

- из тиоловых соединении наиболее благоприятное влияние на сохранности функциональной полноценности половых гамет получены от унитиола и дитиотреитола.

- для кратковременного хранения спермы хряков на основе унитиола и дитиотреитола разработана новая среда глюкозо-цитратно-дитиотретиоло-унитиоловая (ГЦДУ).

- разработана новая среда для криоконсервации эякулятов хряков: глюкозо-хелато-цитратно-глицерино-дитиотреитоло-унитиоло-мочевино-желточная (ГЦДУМЖ).

- определено, что в процессе замораживания-оттаивания в сперматозоидах происходят значительные деструктивные изменения мембранных структур, в результате чего происходит быстрый гидролиз АТФ под действием содержащихся в клетках и семенной плазме ферментов. Эти изменения можно в определенной степени снизить применяя диализный метод разбавления спермы перед замораживанием.

Структура и объем диссертационной работы.

Работа состоит из 3 глав, введения, заключения, списка использованной литературы. Основное содержание работы изложено на 153 страницах машинописного текста, иллюстрировано 15 рисунками и 64 таблицами. Список литературы включает 246 наименований.


Докторант (PhD) Мусабеков А.Т.

Мұсабеков Айдос Түменбайұлы
Қабандпрдың шәуетін криоконсервациялауға арналған ортаның тиімді компоненттерін құру
6D070100 – Биотехнология
философия (PhD) докторы ғылыми дəрежесін алу үшін дайындалған диссертацияның
АҢДАТПАСЫ
Жұмыстың жалпы сипаттамасы. Диссертация алынған нәтижелер деңгейі бойынша мал шаруашылығында құндылығы бар ғылыми-техникалық жұмыстарға жатады, әсіресе шошқа шаруашылығында, ал теориялық және практикалық тұжырымдар жасушалардың криобиологиясымен жұмыс жасаушы ғалымдарда қызығушылық оятады.

Зерттеу жұмысының өзектілігі. Витрификацияның ашылуы шәуетті төмен температуралық консервациялау әдістерін жасауда өте үлкен маңызға ие, өйткені кристаллдық емес мұздату жасушаларға аз зақым келтіреді және олардың өмір сүру қабілетін сақтап қалады. Бірақ бұл жағдай шамамен 50000С/с салқындатудың өте үлкен жылдамдықтары кезінде болып, практикалық тұрғыдан оған жету мүмкін емес. Одан тыс шыны тәріздес жағдай тұрақсыз: -1000С температурадан бастап кристаллдар пайда болады және ірілене бастайды. Бұл құбылыс еріту кезіндегі рекристаллизация немесе миграциондық кристаллизация деп аталады. Рекристаллизация еркектердің жыныстық жасушалары үшін қауіпті. Шыны тәріздес жағдайды 1300С төмен темпертурада сақтау мүмкін. Бұл жағдай ғалымдарды кристаллдық емес мұздатуға жағдай жасайтын қорғаныс заттарын іздестіруге үндеп отыр.

Жануарлар шәуетінің криобиологиясындағы теориялық зерттеулер ауыл шаруашылығы жануарларын жасанды ұрықтандыру әдістерін кең ендіруге және жылдам дамытуға ғана емес, ал жануарлардың генетикалық тұрғыдан құнды және жойылып бара жатқан түрлерін сақтауға да үлкен мүмкіндіктер ашып отыр.

Жануарлардың шәуетін төмен температуралық консервациялау әдістерін сәтті жасақтау салқындату және мұздату кезінде шәуетінің тұрақтылық пен зақымдану механизмдері және себептерін терең танусыз мүмкін емес. Жасушалық демалыс процестерінде және тотығушы фосфорилдеу реакцияларында сульфгидрильдік топтары (SH-) бар төмен молекулярлық тиолдық қосылыстар маңызды роль атқарады. Олар көптеген ферменттер мен коферменттердің белсенді орталықтарына еніп, жасушалардағы ақуыздардың үшінші құрылымын қолдауға қатысады.

Еліміздің шошқа өсіру шаруашылығында жасанды ұрықтандыру әдістерін тек бірнеше шаруашылықтарда ғана қолданады, ал эякуляттарды криконсервациялау технологиясын жасаумен ешкім де айналыспайды. Бұл қабандар шәуетінің төмен криотөзімділігінің биологиялық ерекшеліктеріне, шәуеттің едәуір үлкен көлемін мұздату қажеттілігіне, ұрықтандыру нәтижелерінің тұрақсыздығының технологиялық және әдістемелік қиындықтарына байланысты. Сондықтан қабандардың шәуетін криконсервациялау әдістерін жетілдірудегі, сперматозоидтардың проблемалары өзекті мәселе болып келеді.

Шошқа шаруашылығында жасанды ұрықтандыруды дамытудың заманауи кезеңіндегі мұздатып–еріту және салқындату барысында қабандардың сперматозоидтары мен шәуетіндегі плазмада сульфгидрильдік топтардың санының өзгеруін зерттеу, жаңа алынған спермадағы SH –топтары мен мұздатылып-ерітілген шәуеттің функционалдық толыққандылығы арасындағы қатынасты анықтау, сондай-ақ қабандардың эякуляттарының криотөзімділігін арттыру жолдарын іздестіру өзекті болып отыр. Осыған байланысты шәуетті қысқа және ұзақ мерзімді сақтау үшін тиолдық қосылыстарды қолданушы ортаны жасақтау ғылыми құндылыққа ие, ал алынған нәтижелер инновациялық болып табылады.

Қабандардың шәуетін қысқа және ұзақ мерзімді сақтауды әрі қарай жетілдіру бойынша биотехнологиялық проблемаларды шешу селекциялық-генетикалық параметрлері бойынша жоғары құнды өндіруші-қабандарды пайдалануға, жақын туыстық қашыруды болдырмауға, шошқа аналықтарының өндіруші қабілеттерін арттыруға, жас шошқалардың тез өсу темпіне, сондай-ақ жатырлық бастарды жасанды ұрықтандыру сияқты прогрессивтік әдісті кеңінен ендіруге алып келеді.



Жұмыстың мақсаты. Мұздатылып-ерітілген шәуетті қысқа мерзімді сақтау және криотөзімділігі кезінде функционалдық көрсеткіштердің сақталуына қосылған тиолдық қосылыстардың әсерін, сульфгидрильдік топтар мен эякуляттардың сапасы арасында өзара байланысты зертеу жолымен қабандардың шәуетін криоконсервациялау үшін ортаның тиімді компоненттерін құру.

Диссертациялық жұмыста қойылған мақсатқа жету үшін келесі маңызды зерттеулер жүргізілген:

1. Сперматозоидтар мен эякулят плазмасындағы сульфгидрильдік топтардың сандық көрсеткіштері, олардың шәуеттің сапалық көрсеткіштеріне әсерін зеріттеу;

2. Жаңа алынған және мұздатылған эякуляттардың сапалық көрсеткіштеріне және спермотозоидтардағы тотығушы фосфорилденудің өзгеруіне күкірт құрамдас және тиолдық реагенттердің әсерін зеріттеу;

3. Шәуеттің дегидрогеназалық және цитохромоксидазалық белсенділігіне күкірт құрамдас және тиолдық реагенттердің әсерін зеріттеу.

4. Лактатдегидрогеназа ферментінің изоферменттік спектріне және жалпы белсенділігіне салқындату мен мұздатып-ерітудің әсерін зеріттеу;

5. Қысқа (+2 - 00С) және ұзақ уақыт ( -1960С) сақтау жағдайларында шәуетті сақтау үшін жаңа жасақталған орталармен жоғары құнды өндіруші қабандарды қолдану тиімділігін анықтау;

6. Жаңа өндірістік жағдайларда жаңа араластырғыштармен сақтаудан соң сперматозоидтардың сапалы көрсеткіштерінің сақталуының параметрлерді анықтау;

7. Өндіруші қабандардың шәуеттері үшін құрылған жаңа орталарды қолданудың экономикалық тиімділігі анықтау.

Зерттеу нысаны. Оңтүстік Қазақстан облысының «Достық», «Дидар» және «Ақсұңқар» атты шошқа өсіруші шаруашылықтардың ірі тұқымдас шошқалары. Бірқатар анализдер Жануарлардың генетикасы және көбейту Бүкілресейлік ғылыми зерттеу институтының арнайы зертханаларында, М.О.Әуезов атындағы Оңтүстік Қазқстан мемлекеттік университетінің зертханаларында өткізілді.

Зерттеу әдісі. Эякулят сапасы МЖСТ 20909.4. спермийлер қозғалғыштығын анықтау, спермийлер өміршеңдігін анықтау нұсқауларға сәйкес және жалпы қабылданған әдістемелер бойынша түсіне, исіне, көлеміне, концентрациясына, белсенділігіне және өміршеңдігінің абсолюттік көрсеткішіне қарай бағаланды.

Сперматозоидтардың концентрациясы Горяев камерасында анықталып, 1 мл спермаға млрд. өлшенді. Белсенділігі (түсуші – белсенді жасушалар пайызы) 38-400С температурада ұрық тамшысын микроскопиялық әдіспен анықтап, 10-100% сәйкес келетін 1 ден 10 ға дейінгі баллдармен белгіледік.

Шәует криоконсервациясы -850С пластинкадағы температура кезінде сұйық азот буларындағы фторопласт пластинасында өткізілді. Мұздатылған сперма. ВИЖ конструкциясының гидроерітушісі көмегінде ерітілді.

Зерттеу жұмыстарының ғылыми жаңалығы. Алғаш рет шошқаларды жасанды ұрықтандыру технологиясының практикасында өндіруші қабандардың шәуетінің сапалық көрсеткіштеріне төмен молекулярлық тиолдық қосылыстардың әсері зертелген. Жануарларды көбейтуші теориялық және практикалық негіздерді кеңейтуге және тереңдетуге елеулі мүмкіндік беруші маңызды түбегейлі жаңа бірқатар заңдылықтар анықталды.

Арнайы және арнайы емес әрекеті бар (төмен молекулярлық SH-қосылыстар, несеп) заттардың төмен концентрациясын криоконсервация ортасына енгізу арқылы спермотозоидтардың криотөзімділігін арттыру мүмкіндігі алғаш рет көрсетілген.

Шәуеттің сульфгидрильдік топтары (SH-) мен оның сапалық көрсеткіштері арасындағы өзара байланыс параметрлері анықталған.

Глюкоза- цитрато-дитиотреитол-унитиолдық (ГЦДУ) қысқа мерзімді (+2 - 00С) сақтауға және глюкоза-цитрато-глицерино-дитиотреитол-унитиол-несептік-сарыуыздық (ГЦДУНС) ұзақ уақыт (-196 0С) сақтауға жаңа орталар жасалған.



Жұмыстың ғылыми-тәжірбиелі құндылығы. Эксперименталдық зерттеулердің нәтижелері жасушалық құрылымдардың криозақымдануы мен криоқорғанысының молекулярлық механизмдері түсінігін кеңейтуге, төмен температураның зақымдаушы әрекетіне деген криотөзімділікті арттыру тәсілдерін анықтауға мүмкіндік береді. Криоконсервация ортасының құрамына унитол мен дитиотреитолды енгізу қабан сперматозоидтарының криоконсервациясының нәтижелігін арттырған, ал ұсынылған шәуетті концентрациялау тәсілі хладогентке және мұздатылған шәуетті сақтау үшін арналған ыдыстарға деген қажеттілікті кемітеді. Ендіру үшін мыналар құрылып, ұсынылып отыр:

  • Қабандар шәуетінің криотөзімділігін және сапалы көрсеткіштерін бағалау үшін сульфгидрильдік топтардың құрамын пайдалану;

  • ГЦДУ деген шартты атаулы қысқа мерзімді сақтау үшін жаңа орта;

  • ГХЦДУС деген шартты атаулы шәуетті криоконсервациялау үшін жаңа орта.

Жұмыстың жариялануы және сыннан өтуі. Диссертацияның негізгі зерттеулері 23 жарияланымдарда, соның ішінде 4 Қазақстан Республикасының білім және ғылым саласындағы бақылау Комитеті ұсынылған жарияланымдарда, 1 мақала Thomsоn Reuters дерекқорына кіретін халықаралық ғылыми жарияланымда жарық көрді.

Зерттеу қорытындылары «Повышение продуктивных качеств сельскохозяйственных животных» (Санкт-Петербург 2010), «Стратегические вопросы мировой науки» (Przemysl 2011), «Перспективные научные исследования» (София 2011), «Наука и технологии: шаг в будущее» (Прага 2011), «Повышение интенсивности и конкурентоспособности отраслей животноводства» (Жадино 2011), «Астана Биотех 2011» (Астана 2011) «2nd International Conference on Agricultural and Animal Science» (Maldives 2011) халықаралық ғылыми-тәжірибелік конференцияларында да баяндалған.

Сонымен қатар зеріттеу тәтижелері мынадай ғылыми журналдарда жарияланған; «Зооветеринария» (Ташкент 2010, 2011) «Оңтүстік өңірінің ғылыми хабаршысы» (Шымкент 2011), «Современный научный вестник» (Белгород 2011), «Приднепровский научный вестник» (Днепропетровск 2011), «Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук» (Москва 2012).

Жасалған жұмыстың нәтижесінде төмендегідей қорытындылар жасауға болады:

- Қабан шәуеті сульфгидрильдік топтарының (SH-) мөлшері мен оның сапалық көрсеткіштері арасындағы өзара байланыс параметрлері анықталды;

- Күкірт құрамдас реагенттер мен тиолдық қосылыстар жәрдемінде қабан шәуетіндегі сульфгидрильдік топтарды қорғау тәсілдері практикалық тұрғыдан шешілді және теориялық жағынан негізделді, еріту, криоконсервациялау және қысқа мерзімді сақтау кезінде шәуетті қорғау механизмдері ашылды;

- Тиолдық қосылыстардан жыныстық гаметалардың функционалдық толыққандылығының сақталуына ең қолайлы әсер унитиол мен дитиотреитолдан алынды;

- Қабан шәуетін қысқа уақыт сақтау үшін унитиол мен дитиотреитол негізінде глюкозо-цитратно-дитиотреитол-унитиолдық жаңа орта (ГЦДУ) жасалды.

- Қабан эякуляттарын криоконсервация жасау үшін жаңа глюкозо-хелато-цитратно-глицерино-дитиотреитолдық-несепнәрнәрдік-сарыуыздық (ГЦДУНС) орта жасалды.

- Сперматозоидтардағы мұздатып-еріту процесінде мембарналық құрылымдардың елеулі деструктивтік өзгерулері болатындығы анықталды, оның нәтижесінде жасушалар мен ұрықтық плазмадағы ферменттердің әсерінен АТФ гидролизі жылдам өтеді. Бұл өзгерістерді мұздатудан алдынғы шәуетті араластырудың диализдік әдісін қолдану арқылы төмендету мүмкін.



Жұмыстың құрылымы және көлемі. Диссертациялық жұмыс кіріспеден, 3 тараудан, қорытындыдан, жалпы саны 264 әдебиеттер тізімінен тұрады. Жалпы мәтіндік бөлімі 153 беттен тұратын жұмыс құрамында 15 сурет, 64 кесте бар.

Докторант Мусабеков А.Т.




Musabekov Aidos Tumenbayevich

Development of efficient medium components for boar

semen cryopreservation

ABSTRACT

dissertation for the degree of Doctor of Philosophy (PhD)

specialty 6D070100 - Biotechnology

General description of the work. Dissertation on the level belongs to the scientific and technological developments will be relevant to animal husbandry, in particular pig-breeding, theoretical and practical implications will be of interest to scientists working with cryobiology of cells.

Relevance of the topic of the research. Discovery of vitrification has played an extremely important role in the development of methods for the low-temperature preservation of sperm, as a non-crystalline freezing gives cells little damage and maintains their viability. However, it is comes only at very high cooling rates, on order of 5000 °C/s, which is almost impossible. Furthermore, it was shown that the glassy state is unstable: starting from -100 °C the formation and consolidation of crystals takes place. This phenomenon is called recrystallization during thawing, or migration crystallization. Crystallization is detrimental to male germ cells. Glassy state can be stored at temperatures below -130 °C. This circum stances prompted scientists seek to search protective substances, which could contribute to the non-crystalline freezing.

Theoretical studies in animal sperm cryobiology discovered large prospective opportunities not only in the accelerated development and wide deployment of artificial insemination of farm animals, but also in the preservation of genetically most valuable and threatened species and kinds of animals.

The successful development of methods for low-temperature preservation of semen of animals is not possible without a deep knowledge of the causes and mechanisms of damage and stability of semen during cooling and freezing. It is known that in the process of cellular respiration, oxidative phosphorylation low molecular weight thiol compounds containing sulfhydryl groups (SH) are important. They come in many active sites of enzymes and co-enzymes, and are involved in maintaining the tertiary structure of proteins cells.

In the country pig artificial insemination is used in only a few farms and technology development of kriokonservation of ejaculates does not work. This is due to the biological characteristics of low kriostability of boar semen, freezing need a much larger volume of semen, technological and methodological difficulties on instability of results of insemination. Therefore, the problem of improving the method of cryopreservation of boar semen and seash of means and ways to improve sperm kriostability remains relevant.

At the present stage of development of artificial insemination in swine-breeding study of changes in the amount of sulfhydryl groups in the plasma of boar semen and sperm during cooling and freezing and thawing, the identification between the content of SH groups in freshly obtained semen and functional full freeze-thawed sperm, as well as the search for ways to improve kriostability of ejaculates of boars are relevant. In connection with this development of environments using thiol compounds for both short and long-term storage of semen has scientific value, and the results are innovative.

Decision of biotechnology of to further improvement of short and long term storage of boar semen lead to the use of high-value, ottsennonyh on selection and genetic parameters of breeding boars to, avoid mating closely related, increase reproductive qualities of sows, increasing the growth rate of young pigs, as well as a wider application of the progressive method of artificial insemination breeding stock.



The purpose of research is to develop efficient medium components for boar semen cryopreservation, by studying the relationship between the content of sulfhydryl groups and quality ejaculates, the effect of added thiol compounds for preservation of functional indicators in the short-term storage and frozen-thawed kriostability of sperm. To achieve the goal of the research objectives:

  • 1. The study of quantitative indicators of sulfhydryl groups in the ejaculate and sperm plasma and their effect on semen quality parameters;

  • 2. Investigation of the effect of sulfur and thiol compounds to modify the oxidative phosphorylation in spermatozoa and qualitative indicators of freshly frozen ejaculates;

  • 3. Investigation of the effect of sulfur and thiol reagents on dehydrogenase activity and cylohromoxidas of sperm;

  • 4. Investigation of the effect of cooling and freezing and thawing of the overall activity and isozyme spectrum of enzyme of lactate dehydrogenase;

  • 5. Determination of efficiency of high breeding boars with newly developed media for the storage of sperm in a short-term (+ 2 - 0ºC) and long-term storage (-196ºC);

  • 6. Determining the parameters of preservation of quality indicators of sperm after storage with new diluents in a production environment;

  • 7. Identify cost-effective use of newly developed media for boar semen producers.

The object of the study are a large breed pigs in pig farms "Dostyk", "Didar" and "Aksunkar" South Kazakhstan region. Number of tests performed in specialized laboratories of All-Russian Research Institute of Genetics and Breeding of Farm Animals - Russia, in the laboratories of the South-Kazakhstan State University named after M. Auezov.

Research methods. Semen quality was assessed by color, odor, volume, concentration, activity, and absolute preservstion by conventional methods and in accordance with GOST 20909.4. Determination of motility and GOST 20909.4. Sperm concentration was determined in the Goryaev cell and expressed in billion per 1 ml of semen. Activity (percentage of translational active cells) was determined by microscopic drop of semen at 38 ... 40º C and expressed on a scale from 1 to 10, which corresponds to 10-100 per cent.

Crioconservation semen was performed on Teflon plate in the vapor of liquid nitrogen at a temperature of -85ºC. The plate Thawed frozen semen was thawed through VIZH construction.



Scientific novelty of the study. First time in the technology of artificial insemination of pigs the effect of low molecular weight thiol compounds on the quality indicators of boar semen producers are studied. A number of new and fundamentally important laws, that allows significantly to broaden and deepen the theoretical and practical bases of animal reproductionare revealed.

The possibility of increasing kriostability of sperm cryopreservation by medium introduction of low concentrations of substances with specific and non-specific effects (SH-low molecular weight compounds, urea) is first suggested.

The parameters of the relationship between the content of sulfhydryl groups (SH) of sperm and quality indicators are determined.

New medium short-term storage (+2-00 C) glucose-citrate-unitiolovaya dithiothreitol (GTSDU) and storage (GTSDUMZH) (1960S) developed. The developed environment will allow more efficient use of valuable breeding boars.



Scientific and practical significance of the work. Results of experimental studies have enhanced the understanding of the molecular mechanisms cryodamage and cryoprotection of cell structures, and to determine how to improve the direction kriostability amaging effects of low temperatures. The introduction of cryopreservation medium unitiola and dithiothreitol increased efficiency of boar sperm cryopreservation, and the proposed method of sperm concentration, reducing the need for refrigerant and storage tanks of frozen semen. Developed and submitted for implementation:

- Use of the content of sulfhydryl groups to assess the qualitative indicators toychivosti boar semen;

- A new medium for storage, under the code name of glucose-citrate-unitiolovaya dithiothreitol (GTSDU);

- A new medium for sperm cryopreservation under the code name (GHTSDUZH);



Testing work. The main provisions of the thesis are flected in 23 publications, including four editions of listed Control Committee of Education and Science of the Republic of Kazakhstan. One article was published in international scientific journals included in the database Thomson Reuters. Research results were presented at scientific conferences: «Increasing of productive qualities of farm animals» (St. Petersburg 2010), «Strategic issues in the world of science» (Przemysl 2011), «Advanced Research» (Sofia 2011), «Science and technology: a step forward» (Prague 2011), «Increasing the intensity and competitiveness of the livestock industries» (Zhadino 2011), «Astana Biotech 2011» (Astana 2011) «2nd International Conference on Agricultural and Animal Science» (Maldives 2011). The results of work are published in the scientific journals «Zooveterinary» (Tashkent 2010, 2011) «Scientific Bulletin of the Southern Region» (Shymkent 2011), «Modern Science Bulletin» (Belgorod 2011), «Pridneprovsky Research Bulletin» (Dnepropetrovsk 2011), «Bulletin of the Russian Academy of Agricultural Sciences» (Moscow 2012)

Main results:

- The parameters of the relationship between the content of sulfhydryl groups (SH) boar semen and its quality indicatorsare defined

- Ways to protect sulfhydryl groups of boar semen using thiol compounds and sulfur-containing reagents to reveal the mechanism of protection of sperm in their short-term storage, cryopreservation and thawing are theoretically grounded and practically settled.

- Of thiol compounds, the most beneficial effect on the preservation of functional full sexual gametes are obtained from unitiola and dithiothreitol.

- For short-term storage of boar semen by unitiol and dithiothreitol a new medium of glucose-citrate-ditiotretiolo unitiol (GTSDU) is development.

- A new medium for the cryopreservation of boar ejaculates: (GTSDUMZH).



- It is determined that in the process of freezing and thawing in sperm there are significant destructive changes of membrane structures, resulting in the rapid hydrolysis of ATP by the action contained in the cells and seminal plasma enzymes. These changes can be reduced to some extent by applying dialysis method of sperm dilution before freezing.

The structure and length of the thesis.

The work consists of three chapters, introduction, conclusion, list of references. The main content of the work's described in 153 pages of printed text, illustrated with 15 figures and 64 tables. Bibliography includes 246 references.



©netref.ru 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет