Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме 03. 01. 04 биохимия



жүктеу 493.53 Kb.
бет1/4
Дата03.05.2016
өлшемі493.53 Kb.
  1   2   3   4


На правах рукописи

Скибо Юлия Валерьевна


РЕГУЛЯЦИЯ I И II ТИПОВ ПРОГРАММИРОВАННОЙ

КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ Т-ЛИМФОЦИТОВ

ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ
03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2013
Работа выполнена в НИЛ биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Казань.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Абрамова Зинаида Ивановна



Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор Мустафин Ильшат Ганиевич


Официальные оппоненты: д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза ФГБУ

«Казанский институт биохимии и биофизики» КазНЦ РАН

Чернова Ольга Александровна

д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии ГБУ ВПО "Казанский государственный медицинский университет"

Бойчук Сергей Васильевич




Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Государственный научный центр Институт иммунологии» Федеральное медико-биологическое агентство России (г. Москва).

Защита состоится «21» февраля 2013 г. в 13. 00 на заседании диссертационного Совета Д 212.081.08. при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д.18, главное здание, ауд. 211

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке имени Н.И.Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Автореферат разослан « » января 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д 212.081.08.

д.б.н., профессор З.И.Абрамова

Актуальность проблемы. Для полноценного и правильного развития и морфогенеза в многоклеточном организме существуют различные пути гибели клеток, позволяющие контролировать количество клеток и удалять инфицированные, мутированные или поврежденные клетки (Penaloza, 2006). Апоптоз, программированная смерть клетки по типу I, является звеном многих биологических процессов у многоклеточных организмов (Green, 2009). Он связан с процессом развития и старения клеток, выполняя гомеостатическую функцию удаления поврежденных клеток (Барышников, 2002; Elmore, 2007).

В ходе исследований программы апоптоза, стало ясно, что этот путь гибели клеток не уникален. Кандидатом на роль еще одного механизма смерти стала аутофагия. Аутофагия способствует удалению цитоплазматических компонентов и активируется в ответ на изменение внешних и внутренних условий, например, истощение питательных веществ (Mehrpour, 2010). Аутофагия также может быть механизмом гибели (гибели клеток по типу II) (Pua, 2007). Тем не менее, в то время как апоптоз, безусловно, является механизмом клеточной гибели в условиях стресса, определение аутофагии как механизма самоубийства клеток в ответ на стресс по-прежнему остается весьма спорным.

Взаимодействие между аутофагией и апоптозом является установленным фактом. Аутофагия может приводить к гибели клеток двумя путями. Первый из них состоит в неограниченном «переваривании» содержимого цитоплазмы вплоть до гибели клетки, второй заключается в стимулировании апоптоза. Однако механизмы, посредством, которого происходит переключение с одного процесса на другой, не до конца ясны.

Белки теплового шока представляются новой парадигмой для скоординированного, многоступенчатого регулирования программированной клеточной гибели, позволяющие обеспечить защиту от воздействия разрушительных факторов и облегчить восстановление клеток после них (Beere, 2004). Их способность разбирать, собирать и упаковывать неправильно сложенные белки помогает избегать клетке неблагоприятных последствий от разрушительных агентов (Бобкова, 2011). Эта защитная функция белков теплового шока предполагает их способность подавлять программированную клеточную гибель, в том числе апоптоз и аутофагию.

Установлено, что в формировании аллергической реакции ведущая роль принадлежит Т-лимфоцитам (Pumputiene, 2006; Buc, 2009). Пролонгацию аллергического воспаления при бронхиальной астме связывают с усилением выживаемости Т-лимфоцитов и утратой ими способности к апоптозу (Ярилин, 1999; Бойчук, 2001; Spinozzi, 2008). Недостаточность проявления апоптоза может быть связана с тем, что происходит переключение программированной клеточной гибели с апоптоза на аутофагию.

Целью настоящей работы является характеристика механизмов устойчивости Т-лимфоцитов к программированной клеточной гибели I типа у больных атопической бронхиальной астмой с разной степенью тяжести.

В связи с целью были поставлены следующие задачи:

1. Установить биохимические изменения апоптоза Т-лимфоцитов в динамике у больных легкой и тяжелой формами астмы;

2. Исследовать процесс аутофагии в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой формами астмы.

3. Определить влияние дексаметазона на аутофагию в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой формами астмы.

4. Провести анализ содержания белков теплового шока HSP70 и HSP90 в Т-лимфоцитах in vitro в условиях истощения питательных веществ в зависимости от тяжести астмы.

5. Показать взаимосвязь устойчивости Т-лимфоцитов больных астмой к апоптозу в зависимости от содержания белков теплового шока HSP70 и HSP90;

6. Оценить характер изменений клеточного и гуморального звеньев иммунитета у больных астмой с различной чувствительностью Т-лимфоцитов к апоптозу.


Научная новизна. В работе впервые проведено исследование процесса аутофагии в Т-лимфоцитах больных атопической бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания. Было установлено, что в Т-лимфоцитах больных легкой формой заболевания аутофагия в условиях торможения апоптоза способствует индукции программированной клеточной гибели II типа. В Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмы установлена одновременная активация и апоптоза, и аутофагии.


Впервые получены результаты о влиянии дексаметазона, как терапевтического препарата, на процесс аутофагии в зависимости от степени тяжести заболевания. У больных с легкой формой бронхиальной астмы дексаметазон индуцирует ранние этапы апоптоза, но ингибирует аутофагию. У больных тяжелой формой заболевания дексаметазон способствует интенсивной активации аутофагии, что приводит к пролонгации функционирования Т-лимфоцитов.

Показано различное содержание белков теплового шока HSP70 и HSP90 в зависимости от степени тяжести атопической бронхиальной астмы. У больных с легкой формой заболевания установлено повышение уровня HSP90 в условиях in vitro. В группе больных с тяжелой формой астмы установлено наличие как HSP70, так и HSP90, внутриклеточное содержание которых снижалось в процессе культивирования Т-лимфоцитов в связи с их выходом во внеклеточное пространство. Секреция HSP70 и HSP90 в межклеточную среду коррелирует с активацией апоптоза и аутофагии.


Научно-практическая значимость. Полученные результаты, свидетельствующие об активации аутофагии в Т-лимфоцитах больных атопической бронхиальной астмой, расширяют существующие представления о роли программированной клеточной гибели в функционировании иммунной системы. В частности, установлено, что аутофагия способствует длительному функционированию Т-лимфоцитов при тяжелой форме астмы, что приводит к персистенции заболевания. При легкой форме заболевания устойчивость Т-лимфоцитов к апоптозу (ПКГ I типа) компенсируется индукцией ПКГ II типа (т.е. гибелью клеток по типу аутофагии). Различные проявления аутофагии в Т-лимфоцитах в зависимости от тяжести бронхиальной астмы могут быть использованы для поиска новых терапевтических мишеней в лечении астмы.

Особый интерес для практического применения имеют полученные в работе данные о роли белков теплового шока HSP70 и HSP90 и их взаимосвязь с апоптозом и аутофагией, что может послужить основанием для их использования в коррекции программированной клеточной гибели. Применение терапевтических веществ, в том числе дексаметазона, снижающих накопление белка Hsp90 внутри клеток, может способствовать повышению апоптотического процесса в Т-лимфоцитах у больных легкой и тяжелой формами АБА.

Установленная в работе активация аутофагии в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой под влиянием дексаметазона расширяет спектр действия данного глюкокортикостероида и имеющиеся в настоящее время данные о его влиянии на иммунную систему и воспаление.
Положения, выносимые на защиту:

1. Устойчивость Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой и тяжелой формами астмы к I типу программированной клеточной гибели (апоптозу) сопровождается активацией аутофагии.

2. Снижение апоптотической активности и активация аутофагии в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмы сопровождаются накоплением внутриклеточных белков теплового шока HSP70 и HSP90.

3. Дексаметазон является одним из экзогенных факторов, оказывающих стимулирующее влияние на аутофагию в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой бронхиальной астмой.


Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на II Международном молодежном медицинском конгрессе “Санкт-Петербургские научные чтения” (г. Санкт-Петербург, 2007); на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г.Казань, 2008); на IV международном съезде биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008); на XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (г. Москва, 2009); на Х Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009); на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия-2009» (г. Пермь, 2009); на XIII Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2009 г.; на XIII Европейском симпозиуме студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-2009» (г. Казань, 2009); на I Всероссийской интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (г. Казань, 2010); на 4 Международной конференции для молодых ученых “Molecular biology: advances and perspectives” (Kyiv, 2011); на IV Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (г. Казань, 2012); на 7 Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г.Челябинске», 2012 г; на Международном форуме, посвященный тяжелой форме астмы ISAF-2012 (Gothenburg, Sweden); на III Международной научной онлайн-конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (г. Казань, 2012).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 6 статей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и списка литературы (319 источников, из них 42 отечественных и 277 зарубежных). Диссертация содержит 3 таблицы и 46 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Объектом изучения послужили Т-лимфоциты периферической крови здоровых доноров и больных атопической бронхиальной астмой с легкой и тяжелой формами заболевания. Диагноз и степень тяжести атопической бронхиальной астмы верифицировали согласно критериям «Глобальной стратегии диагностики, профилактики и лечения астмы» (GINA, 2008).

Выделение субпопуляции Т-лимфоцитов. Лейкоцитарную фракцию выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фиколл (ρ = 1,077). Для получения чистой популяции Т-лимфоцитов использовали метод иммуномагнитной сепарации с использованием антител к поверхностному рецептору Т-лимфоцитов - CD3 (Dynabeads Untouched Human T cells, Dynal, Invitrogen).

Культивирование Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты инкубировали в СО2-инкубаторе (с 5 %-ным СО2) в питательной среде RPMI-1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (10%), пенициллин/стрептомицин (5000 ед/мл/5000 мкг/мл) и L-глутамин (1%) в расчете 2×106кл./мл. В качестве индуктора апоптоза использовали дексаметазон (10-2 М) (конечная концентрация 10-4 М).

Оценка апоптоза Т-лимфоцитов. Оценку апоптоза Т-лимфоцитов проводили на 3 и 6 сутки культивирования с использованием нескольких методов, включающие:

  • выявление экспрессии фосфатидилсерина на поверхности Т-лимфоцитов

флуоресцентной меткой мероцианином 540 (МС540) по следующему протоколу. Раствор МС540 (концентрация 1 мг/мл) в объёме 5 мкл вносили в 1 мл клеточной суспензии, содержащей 1×106 кл/мл. Клеточную суспензию перемешивали и инкубировали в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. Регистрацию результатов осуществляли на втором детекторе FL2 цитометра. На каждый вариант опыта просчитывали не менее 10000 клеток.

  • выявление фрагментации ДНК в Т-лимфоцитах с применением набора FITC

Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen). Для выявления фрагментации ДНК в Т-лимфоцитах клетки отмывали дважды холодным ФСБ, после чего ресуспендировали в 1X Аннексин V связывающем буфере в концентрации 1 х 106 клеток / мл. К суспензии клеток добавляли 5 мкл аннексина V и 5 мкл пропидий йодида (PI). Клеточную суспензию инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Затем добавляли 400 мкл 1X Аннексин V связывающего буфера. Образцы анализировали на первом FL1и третьем FL3 детекторах цитометра в течение 1 часа с применением программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson). На каждый вариант опыта просчитывали не менее 10000 клеток.

Регистрацию результатов осуществляли методом проточной цитофлюорометрии на приборе FACSСalibur (“Весton Dickinson”).



Ультраструктурная характеристика Т-лимфоцитов. Клеточную суспензию центрифугировали в течение 10 мин 2000 rpm при +18°С (Eppendorf, 5810R), супернатант удаляли, а полученный осадок из Т-лимфоцитов фиксировали в 2,5 %-ном растворе глутарового альдегида (1 - 2 ч) и в 1 %-ном растворе ОsO4 (2 ч). Далее образцы дегидратировали в этаноле восходящей концентрации (300, 400, 500, 600, 700, 960), ацетоне и окиси пропилена. Материал заливали эпоксидной смолой Эпон – 812. Полимеризовали образцы в течение трёх суток в термостате при температуре 37, 45 и 600С.

Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме "Ultratom III" (ЛКБ, Швеция). Срезы контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца. Препараты просматривались на электронном микроскопе Hitachi -125 (Япония).



Оценка аутофагии в Т-лимфоцитах. Визуализацию аутофагосом проводили после 3 дней культивирования с применением первичных моноклональных антител (LC3B rabbit monoclonal antibody, Invitrogen) и вторичных меченых FITC антител (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG, Invitrogen) на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss AxioScope A1 (оснащенный видеокамерой AxioCam MRc5). После окончания культивирования клетки отмывали ФСБ, добавляли 3,7% формальдегид, приготовленный на ФСБ, и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Фиксатор удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 2000 rpm при +18°С (Eppendorf, 5815R). Затем клетки промывали три раза ФСБ. После отмывки от фиксатора к клеткам добавляли 0,2% Triton X-100, приготовленный на ФСБ, и инкубировали их в течение 15 минут при комнатной температуре. Пермебилизирующий буфер удаляли центрифугированием в течение 10 мин при 2000 rpm при +18°С (Eppendorf, 5815R). Добавляли рабочий раствор первичных антител к клеткам и инкубировали их в течение 1 часа при комнатной температуре. По окончанию инкубации удаляли раствор первичных антител центрифугированием в течение 10 мин при 2000 rpm при +18°С (Eppendorf, 5815R) и промывали клетки три раза ФСБ. Затем инкубировали клетки со вторичными антителами в течение 1 часа в темноте при комнатной температуре. Клетки промывали ФСБ, заключали под покровное стекло и вузиализировали аутофагосомы под флуоресцентным микроскопом.

Электрофоретическое разделение клеточных белков и вестерн-блотт анализ. Для разделения клеточных белков использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфат натрия (Laemmli, 1970). Гели, содержащие 4% и 8% акриламид (концентрирующий и разделяющий гели, соответственно), готовили с использованием 30% акриламида и 0,7% раствора метиленбисакриламида. Для полимеризации гелей использовали ТЕМЕД и персульфат аммония. Электрофорез проводили в вертикальном направлении при силе тока 30мА/гель в электродном буфере.

По окончанию электрофореза инкубировали гель, нитроцеллюлозную мембрану, фильтровальную бумагу и спонжи в холодном Трансфер буфере в течение 15 мин. Затем собирали сэнвич, заполняли систему для переноса тем же буфером. Запускали блоттинг с постоянным током 350 мА в течение 1,30 ч для 2 гелей или 45 мин для 1 геля. После переноса белков, мембрану промывали в ФСБТ буфере и помещали в блокирующий буфер. Инкубация 1 час при комнатной температуре. Затем мембрану промывали ФСБТ буфером, добавляли первичные антитела (против HSP70, HSP90, LC3B и α-тубулина) и инкубировали в течение ночи при +4°C. Спустя 12 часов мембрану промывали в ФСБТ и добавляли вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена. Инкубировали 1 час при комнатной температуре. Далее мембрану промывали ФСБТ буфером, инкубировали в течение 1 мин с люминолом на основе хемилюминисцентного субстрата (ECL) и детектировали хемилюминисценцию целевых белков с помощью хемидокументирующей системы ChemiDoc™ XRS+.



Оценка содержания внеклеточных белков теплового шока HSP70 и HSP90. После культивирования Т-лимфоцитов проводилось осаждение всех белков питательной среды, в которой находились Т-клетки в процессе роста, сульфатом аммония. Затем проводили диализ против фосфатно-солевого буфера (pH 7,4). Для разделения внеклеточных белков использовали метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli, 1970). Содержание белков HSP70 и HSP90 оценивали методом иммуноблоттинга.

Фенотипирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии. Популяции лимфоцитов были проанализированы на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с применением программных обеспечений CellQuest и MultiSet (Becton Dickinson). Для исследований брали по 50 мкл цельной крови с антикоагулянтом. Окрашивание клеток проводили с использованием комбинаций двух-, четырехцветных моноклональных антител поставляемых в наборе MultiTEST IMK (Becton Dickinson): CD3+; CD8+; CD45+; CD4+ и CD3+; CD16 +; CD56+; CD45+; CD19+ в течение 15 минут в темноте в соответствии с протоколом.

Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке. Содержание иммуноглобулинов IgА, IgM, IgG в сыворотке крови оценивали методом радиальной иммунодиффузии по G. Mancini (Mancini G., 1965 г.), IgE — иммуноферментным методом (ЗАО «ДИАплюс», Москва) согласно инструкции производителя.

Выделение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Выделение гигантских, крупных, средних и мелких ЦИК проводили осаждением 125 мкл сыворотки крови, разбавленной в 0,2 М боратном буфере, рН 8,6-соответственно 3, 3.5, 4 и 7% ПЭГ (6 кДа) в конечном объеме инкубационной смеси. После инкубации при 4С в течение 18-20 часов смесь центрифугировали в течение 10 минут при 3000 rpm (Eppendorf, 5415R). Полученные осадки содержали разные по размеру фракции ЦИК, условно названные гигантскими (3%), крупными (3.5%) и средними (4%). К надосадочному раствору 3.5% ПЭГ добавляли 22% раствор ПЭГ в том же буфере до конечной концентрации 7%, инкубировали при 4С в течение 18-20 часов и осадок, содержащий мелкие ЦИК, отделяли центрифугированием. Для оценки количественного содержания ЦИК в сыворотке крови полученные осадки суспендировали в 0,1 М NaОН и измеряли плотность оптического поглащения в УФ-области спектра при 280 нм.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием структурных характеристик (медианы, перцентиля), а для оценки различий между отдельными выборками применяли непараметрические критерии Крускала-Уоллиса (для общей характеристик выборки) и T-критерия Манна – Уитни (для парных сравнений различных выборок) (Акберова, 2004). Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмена-rs. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Определение морфологии Т-лимфоцитов здоровых доноров и больных атопической бронхиальной астмой
Методами трансмиссионной электронной (ТЭМ) и атомно-силовой микроскопий (АСМ) были получены микрофотографии Т-лимфоцитов в различных группах.

На полученных микрофотографиях Т-лимфоцитов здоровых доноров клетки имеют правильную округлую форму (рис. 1). Клеточная мембрана ровная, без инвагинаций. Ядро, как правило, расположено центрально и занимает большую часть клетки: локализация хроматина периферическая, кариоплазма электронно-светлая. Все мембранные структуры целостны и хорошо прорисованы - митохондрии правильной формы с хорошо дифференцированными кристами. Чаще всего, скопления митохондрий наблюдаются медиально, недалеко от ядра. В цитоплазме различимы рибосомы, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум. Наличие микроворсинок на поверхности плазматической мембраны свидетельствует об их функционально активном состоянии. Результаты ТЭМ подтверждались данными АСМ (рис. 1,б).

Среди структурно-функциональных систем клетки важную роль играет плазматическая мембрана, обеспечивающая барьер клетки, ионный транспорт, внутриклеточную передачу информации и т.д. Важнейшими компонентами плазматической мембраны являются белки. Они определяют морфологические и механические свойства клетки, нарушение которых может приводить к изменению ее жизнедеятельности или даже гибели.

Атомно-силовая микроскопия позволяет получать информацию о поверхности клеток. Мы установили, что на плазматической мембране Т-лимфоцитов четко выявляются глобулы, предположительно, являющиеся частью мембранных интегральных и полуинтегральных белков, а также фрагментов гликокаликса (рис. 1, в). Размер глобул составляет 50±7,5 нм, р<0,05. Плазматическая мембрана контрольных лимфоцитов отличается диффузионным, упорядоченным рельефом.




а

б

в
  1   2   3   4


©netref.ru 2016
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет