Сэр Джон Дэвис. "Orchestra" ( XVI век)



жүктеу 352.13 Kb.
Дата01.05.2016
өлшемі352.13 Kb.
: docs -> docs -> large files
docs -> Қазақстан Республикасы Денсаулық сақтау министрінің 2009 жылғы 24 қарашадағы №764 бұйрығы «Халық денсаулығы және денсаулық сақтау жүйесі туралы»
docs -> Бұрын белгісіз болған оқиға жөніндегі кез келген мәлімет аталады
docs -> Методические рекомендации по подготовке и проведению мероприятий, посвященных 70-й годовщине победы в великой отечественной войне 1941-1945 гг
large files -> Xxiv любищевские чтения. Современные проблемы экологии и эволюции. Ульяновск: Улгпу, 2010. С. 179-189


«Но если всё вокруг

………………………………………

Составлено из комбинаций разных

Частиц, то что их вместе держит

В гармонии чудесной?

Неправы те, кто с лёгкостью

Всё объявить готов случайным:

Любовь ведёт частицы в танце бальном!»

Сэр Джон Дэвис. “Orchestra” ( XVI век)

Повторы в геномах бактерий; связь с эволюцией


Г. Б. Смирнов

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва

E-mail: smirngb@yandex.ru

Общие положения.

Для того чтобы функционировать, ДНК геномов должна взаимодействовать с белками. Это нужно для обеспечения самых разнообразных механизмов регуляции активности оперонов и отдельных генов, для репликации, репарации и, конечно, рекомбинации. Рекомбинация, в свою очередь, совершенно необходима для осуществления перестроек геномов, без которых невозможно себе представить эволюцию. Взаимодействия белков и ДНК происходят не по всей длине её молекулы, а в избранных специфических местах, которые белки должны правильно узнавать.

Как для узнавания вообще, так и для узнавания белками ДНК, в частности, нужны какие-то признаки, определяющие отличия одного сайта от другого. Отличительным признаком, узнаваемым белками, может служить последовательность нуклеотидов как таковая. Действительно, такой механизм работает. Однако появляется всё больше и больше данных, которые говорят о том, что этот механизм не является единственным и, более того, не является мажорным. Гораздо чаще для формирования сайтов взаимодействия белков с ДНК геном использует фигуры симметрии, а именно, повторы нуклеотидных последовательностей.

Окончательной и единой классификации повторов не существует, поэтому в данной работе, в основном, будут использованы наиболее часто встречающиеся определения. В качестве первичной классификации повторов можно представить следующую.



По ориентации частей повторов их можно разделить на прямые (DR) и обращённые (IR).

По длине их можно разделить на короткие (SSR) и длинные (LR).

По расположению друг относительно друга их можно разделить на прилежащие или смежные (contiguous) и диспергированные (interspersed или SPIDR - Spacer interspersed direct repeats), иногда употребляется термин близкие повторы (СR). Одна из разновидностей первых – тандемные повторы (TR).

По расположению относительно генов их можно разделить на внутригенные (intragenic) и межгенные (intergenic).

По степени связи с другими структурами повторы можно разделить на автономные или диспергированные (FR – free repeats) и связанные с генами или элементами (EAR – element-associated repeats).
Настоящая работа посвящена повторам в бактериальных геномах, однако, учитывая то, что надцарство прокариот кроме бактерий содержит домен архей, представляется целесообразным в подходящих случаях обращаться к их сравнению с бактериями.
Сравнение геномов бактерий и архей показывает, что размеры большинства архейных геномов находятся в очень узком диапазоне, тогда как размеры бактериальных геномов варьируют в очень широких пределах (Рис. 1). При этом, у бактерии Carsonella rudii геном (159 662 п.о.) близок к минимально возможному для эндосимбионтов, рассчитанному на компьютере, а у Sorangium cellulosum – почти не отличается от верхнего «бюрократического» предела Ван Нимвегена, рассчитанного для свободноживущей прокариотической клетки, и составляет 13 033 779 п.о. (20).

Рис. 1. Диапазоны размеров геномов бактерий и архей.

По оси абсцисс: размеры геномов в млн. п.о.

По оси ординат: количество геномов.

Сплошная кривая – геномы бактерий; пунктирная кривая – геномы архей.

А – геном C.rudii; B – геном N.equitans; C – минимальный размер для свободноживущих микроорганизмов; D – основной пик размера генома для бактерий и архей; Е – минорный пик размера генома для бактерий; F – геном Nostoc punctiforme; G – геном Sorangium cellulosum; H – предел Ван Нимвегена.



Рис. 2. Схема строения сайта интеграции.

att – сайт интеграции.

О – центральная уникальная часть.

LR – левый повтор.

RR – правый повтор.

Стрелки обозначают ориентацию повторов нуклеотидных последовательностей ДНК.


a

Б






a b




Рис. 3. Делеции и дупликации CR (A) и SSR (Б).

Прямоугольники – повторы.

а – делеции; b – дупликации.



Рис. 4. Схема строения CRISPR-cas системы.

Участок ДНК между генами cas и повторами CRISPR – лидерная последовательность; спейсеры имеют различные нуклеотидные последовательности.

Рис. 5. Схема строения белка ActA.

SS – сигнальная последовательность;

TM – трансмембранный домен;

АP – участок, требуемый для полимеризации актина;

PRR – повторы;

LR1 и LR2 – спейсеры, гомологичные между собой;

LR3 – спейсер, не гомологичный LR1 и LR2.

У архей этого не наблюдается. Применительно к эволюционному значению диапазонов размеров геномов бактерий и архей уместны следующие соображения. То, что внешне очень похожие клетки бактерий и архей резко отличаются по этому показателю, трудно объяснить за счёт различий в условиях их существования. Известны гипер-термофильные, психрофильные, мезофильные, ацидофильные, алкалифильные, барофильные, галофильные, ксерофильные археи. Отрезок времени, в течение которого эволюционировали бактерии и археи, один и тот же. Кривые, представленные на рис.1, говорят о том, что и археи, и бактерии имели исходный геном размером почти 2 МВ. В ходе эволюции бактерии активно теряли и приобретали ДНК, в результате чего и возникло наблюдаемое в настоящее время разнообразие геномных размеров. Ничего подобного не происходило с археями, существовавшими в то же время на той же планете. Вопросу о том, как могли изменяться геномы бактерий, и как они изменяются сейчас, посвящено очень большое количество исследований (см. 2). Однако остаётся совершенно непонятным, почему бактерии создали разнообразие размеров геномов, а археи – нет. Карл Уойз – исследователь, открывший археи, писал: «Почему археабактерии и эубактерии так различны? Как нам понять эти принципиальные различия между двумя типами прокариот? Являются ли они следствием различных условий внешней среды на ранних стадиях эволюции в этих двух линиях? Отражают ли различия в организации у клеток этих двух типов различные эволюционные наклонности? Сейчас мы не в состоянии ответить на эти вопросы. Дело не в том, что просто не хватает фактов; не хватает ключевой концепции» (46). Со времени этого высказывания Уойза прошло больше 20 лет. Но мы, по-прежнему, не имеем ответов на поставленные им вопросы. 1)

Накопленные к настоящему моменту факты, на мой взгляд, неопровержимо указывают на то, что а) именно повторы обеспечивают регуляцию разнообразных генетических процессов в ходе жизненного цикла, и б) повторы являются основой наследственной изменчивости бактерий. Повторы есть и в геномах архей, но там они распределены, в основном, иным образом, нежели в бактериальных. Эти данные будут представлены ниже.



  1. По современным оценкам общая биомасса архей на Земле составляет 1014 тонн, что значительно больше, чем суммарная биомасса всех живущих на Земле организмов (см. О.В. Морозова. Вестник ВОГиС, 2005, Том 9, № 1, С.55-66), и на несколько порядков превышает общую биомассу бактерий (около 2-5х1011 тонн). Такой абсолютный эволюционный успех находится в противоречии с относительно слабо выраженным видовым разнообразием архей. Количество известных видов бактерий составляет около 2 500, тогда как у архей их, как минимум, на порядок меньше. До сих пор считалось, что видовое разнообразие является одним из основных признаков эволюционной успешности. Видимо, для архей это положение несправедливо.

Геномы бактерий различных видов (а иногда даже штаммов) отличаются по наличию или отсутствию повторов определённых типов, и по количеству повторов в геноме (см. 2). Плотность повторов обратно пропорциональна размеру генома (35).

Несмотря на максимальную компактность бактериальных геномов и априорную направленность селекции против сохранения прямых повторов (24), практически не существует геномов, в которых вообще не было бы повторов. Достаточно сказать, что даже один из самых маленьких – геном Nanoarchaeum equitans содержит незначительное количество не кодирующих повторов (45).

Повторы могут быть диспергированными, т.е. относительно беспорядочно разбросанными по длине молекулы ДНК, или организованными в определённые структуры. К последним относятся повторы, входящие в состав мобильных элементов, сайтов интеграции геномов умеренных бактериофагов, сайтов принадлежащих интегронам или сцепленных с генами тРНК. Будем называть их «организованные повторы». Обычно общая схема строения таких повторов выглядит следующим образом: левый элемент повтора – уникальная часть – правый элемент повтора (Рис. 2). В подавляющем большинстве случаев элементы, построенные по такой схеме, содержат повторы в обратной ориентации (IR). Исключение составляет, например, Tn9. Как диспергированные, так и организованные повторы, играют первостепенную роль в процессах рекомбинации. Попытаемся оценить вклад этих разновидностей повторяющихся последовательностей в каждый из известных типов рекомбинации.

Принципиально одинаковые структуры, содержащие повторы, могут находиться как в мобильном (донорном) элементе, так и в реципиентной молекуле ДНК. В зависимости от присутствия организованных повторов в реципиентном геноме или в донорном сегменте я предлагаю разделить типы их взаимодействия на классы.

Класс I. Организованные повторы присутствуют только в структуре донорного сегмента ДНК. В этом случае специфичность интеграции низкая, т.е. количество сайтов интеграции большое и выбор сайта интеграции относительно независим от структуры реципиентной молекулы ДНК. Примеры: IS-элементы, транспозоны. (Исключение составляет интеграция Tn7 в хромосому E.coli. ).

Класс II. Организованные повторы присутствуют только в структуре реципиентного сегмента ДНК. В этом случае специфичность интеграции относительно высокая, т.е. количество сайтов интеграции небольшое и зависит от структуры реципиентной молекулы ДНК. Примеры: инегроны, сайты интеграции, сцепленные с генами тРНК, возможно DUS-элементы.

Класс III. Организованный повтор присутствует в структуре как донорного сегмента, так и реципиентной ДНК. При этом, донорный и реципиентный повторы коэволюционировали и имеют структурное родство. В этом случае специфичность интеграции абсолютная, т.е. существует только один сайт интеграции в реципиентном геноме. Примеры: интеграция геномов умеренных бактериофагов.

Таким образом, мы видим, что присутствие организованных повторов в донорном сегменте или реципиентной структуре принципиально определяет результат взаимодействия этих структур. Конечно, количество сайтов интеграции внешней ДНК в геном реципиента и локализация этих сайтов имеют безусловное значение для эволюционного процесса.

Теперь рассмотрим, какое значение для геномных перестроек имеют диспергированные повторы. Эти повторы разнообразны по нуклеотидным последовательностям, размеру, количеству копий и самому наличию в геномах бактерий. Повторы являются горячими точками геномных перестроек, вовлекающих крупные сегменты генома. Такими перестройками могут быть инверсии, делеции, дупликации и транслокации. Обычно прямые повторы стимулируют делеции, дупликации и транслокации, а инвертированные повторы – инверсии (38, 37, 36).

Диспергированные повторы могут также служить и сайтами интеграции для мобильных элементов. Так, предпочтительными сайтами узнавания для транспозаз в геномах микроорганизмов различных видов оказались внегенные повторяющиеся палиндромы REP (repetitive extragenic palindromes) (41). Тем не менее, специфичность интеграции IS- элементов и большинства транспозонов достаточно низкая (23).

Роль повторов в возникновении геномных перестроек сейчас доказана, в том числе в исследованиях по сравнительной геномике близкородственных микроорганизмов. Сравнивали нуклеотидные последовательности геномов пар Mycobacterium leprae - Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis - Bordetella bronchiseptica, Bartonella quintana - Bartonella henselae, Burkholderia mallei-Burkholderia pseudomallei. Отличия между геномами членов пар во многих случаях были представлены делециями, транслокациями и инверсиями. На границах сегментов ДНК, претерпевших указанные перестройки, всегда обнаруживались те или иные повторы, IS-элементы, гены тРНК, части геномов профагов (10, 7, 27). Та же закономерность имеет место у Y.pestis: делеция 102 т.н.п. локуса pgm происходит с высокой частотой (10-4) за счёт рекомбинации между двумя копиями фланкирующих элементов IS100 (15).

Тип и локализация в геноме повторов различных типов определяют вероятность, характер и локализацию геномных перестроек. При этом, не только локализация, но и само присутствие IS-элементов в геномах не случайно. Например, максимальный размер повторов колеблется от 29 н.п. у Buchnera aphidicola до 14 317 н.п. у Xylella fastidiosa, а плотность повторов на 106 н.п. – от 12 у Chlamydia trachomatis до 5,069 у Streptococcus pneumoniae (4). Различная плотность повторов определяет и различную длину участка ДНК, который может быть вовлечён в рекомбинационный акт. Средняя длина такого участка варьирует от 185 н.п. у C. trachomatis до 1,024,894 н.п. у цианобактерий (Nostoc sp.) (4). Известно, что локализация, количество и тип повторов в геномах в существенной мере видоспецифичны, соответственно, характер и частоты геномных перестроек являются относительно видоспецифичными (4).



Образование повторов.

Как возникают повторы, каковы их основные свойства и что определяет их распределение по геномам?

Геномы бактерий содержат преимущественно короткие тандемные повторы, такие как семейство "variable number of tandem repeats" (VNTR), семейство SSR и близкие повторы - семейство CR. Они могут образовываться как в результате различных вариантов неравного кроссинговера, так и ошибок репликации при редактировании (slipped strand mispairing) или репарации. Проскальзывание наблюдается при временной остановке репликативной вилки, которая сопровождается частичной денатурацией матричной и вновь синтезированной цепей ДНК и спариванию с близлежащим участком полной или частичной гомологии. Это может, в частности, привести как к делеции, так и к дупликации с образованием прямого повтора (Рис. 3) (21, см. 44).

В целом, динамика образования повторов в бактериальной ДНК выглядит следующим образом: образовавшиеся короткие повторы (CR, SSR) служат праймерами для последующей амплификации, т.е. образования тандемных дупликаций, которые в свою очередь за счёт перестроек преобразуются в диспергированные повторы (3)..



Повторы определяют тип и параметры рекомбинационных событий.

Наличие прямых повторов способствует рекомбинационным событиям типа незаконных, причём их вероятность намного выше, если повторы расположены недалеко друг от друга (8, 22). Отмечена также прямая зависимость между размером повтора и вероятностью рекомбинации (30, 31). Наконец, частота незаконной рекомбинации зависит от нуклеотидного состава повтора (14) и его локализации в геноме (42).

Установлено, что близко расположенные прямые повторы (close direct repeats - СDR) находятся в избытке по сравнению с повторами других типов во всех геномах. В наибольшей степени это характерно для одного из самых маленьких геномов M.genitalium.

Увеличение расстояния между повторами приводит к их стабилизации и достигается за счёт транспозиций (внедрения между повторами) и других геномных перестроек. Частота делеций частей повтора прямо пропорциональна размеру повторяющихся последовательностей и обратно пропорциональна длине спейсера, поэтому, чем длиннее стабильные повторы, тем больше должно быть расстояние между ними (8, 22, 5, 30).

Повторы, стимулирующие незаконную рекомбинацию, преимущественно представлены 4-мя классами :

- близкие повторы (CR-close repeats) – это не мультикопийные повторы из 8-10 оснований, разделённые небольшими спейсерами (32) имеют незначительный рекомбинационный потенциал; в бактериальных геномах встречаются относительно часто, причём чаще в составе генов, чем между генами;

- диспергированные повторы (SPIDR – spacer interspersed direct repeats) – это мультикопийные CR, разделённые спейсерами, которые не повторяются, т.е. разными (18);

- простые повторы (SSR-simple sequence repeats) – это очень короткие тандемные повторы из 1-5 оснований, имеющие значительный рекомбинационный потенциал, в бактериальных геномах встречаются намного реже, чем в эукариотических (44);

- TR – это тандемные повторы большей протяжённости (больше 5).

Следует отметить, что именно локализация SSR составляет одно из отличий геномов эубактерий и архей. У бактерий эти повторы располагаются, в основном, в межгенных областях, тогда как у архей - находятся преимущественно в пределах кодирующих последовательностей. Динуклеотидные повторы в геномах архей почти не обнаруживаются. Преимущественными типами архейных SSR являются три- и пентануклеотиды. Плотность повторов у архей никак не коррелирует с размером геномов. И, что очень важно, количество, плотность и тип повторов во многих случаях носят видоспецифический характер (изучены 19 видов архей) (43). Другим существенным отличием является представленность в геномах бактерий и архей повторов CRISPR (см. ниже).

Гомологическая рекомбинация у E. coli также определяется многочисленными диспергированными повторами октамера (5' - GCTGGTGG - 3'), названного последовательность Chi и узнаваемого экзонуклеазой V (RecBCD). Интересно, что у бактерий разных видов последовательности Chi отличаются, т.е. эволюционировали независимо.

8 странных семейств

В ДНК цианобактерий Nostoc punctiforme обнаружены очень короткие повторы, названные SDR (small dispersed repeats) (Elhai J., Kato M., Cousins S, Lindblad P., Costa J.L. Very small mobile repeated elements in cyanobacterial genomes. Genome Res. 2008. 18: 1484-1499). Идентифицированы 8 семейств SDR. Размеры SDR варьируют от 21 до 27 н.п.

Первая странность относится к сайтам локализации SDR. Так, члены семейства SDR5 обнаруживаются только внутри октамера HIP1 (GCGATCGC), который представлен в составе геномов цианобактерий в огромном количестве копий. Повторы семейств SDR1 и SDR4 внедряются в свои собственные копии. При этом никакого предпочтительного сайта интеграции не обнаруживается, – внедрения происходят в разные сайты внутри элемента SDR, независимо от того, где находится сам элемент SDR-мишень. Иными словами, элементы SDR1 и SDR4 при внедрении узнают не предпочтительный сайт, а свою собственную структуру в целом. SDR большинства семейств очень часто обнаруживаются в составе транспозонов и мини транспозонов. И в этом случае предпочтительных сайтов локализации SDR не просматривается.

Вторая странность состоит в том, что SDR семейств 1,4 и 5 мобильны, хотя ни рекомбинация, ни конверсия, ни классическая транспозиция с их участием не происходят. Авторы предполагают, что в основе мобильности SDR лежит процесс с участием РНК, как промежуточного продукта.

Третья необычная особенность относится к структуре повторов. Представители семейств SDR4, SDR5, и SDR6 имеют в своём составе по 2 GC-богатых участка, потенциально способных образовывать структуры типа «стебель-петля». В подобии петель находятся всего 2 нуклеотида, поэтому эти 2 участка – почти палиндромы. 6 подсемейств SDR1 содержат консервативное ядро из 10 нуклеотидов (GAGCGAGCGA), которое окружено инвертированными повторами из 4-х оснований. Удивительно, что IR не являются концевыми и не обеспечивают перемещений ядра. 2 подсемейства SDR2 тоже имеют консервативное ядро, но оно состоит из 20 нуклеотидов, которые являются палиндромом. Длинный совершенный палиндром присутствует также в SDR7.

Внедрения SDR в состав транспозонов могут способствовать их более успешному распространению по геномам. Такие SDR можно назвать «наездниками». Все остальные свойства этих повторов, на мой взгляд, пока труднообъяснимы, а их происхождение и роль в функционировании геномов неясны.



Кодирующие палиндромы.

Мы видели, что повторы могут служить сигналами, включающими механизмы геномных перестроек и структурными элементами, на которых эти механизмы оперируют. Наиболее эффективными в эволюционном отношении, по общему мнению, являются дупликации и события горизонтального переноса генов. Однако ни то, ни другое событие не образует гены de novo, а оперирует на уже существовавших генах. Их эволюционную значимость это не снижает, но вопрос о происхождении генов, принадлежавших предшественнику, остаётся нерешённым. Так же не очень понятно, почему у бактерий разных видов существует множество генов, которые не встречаются в микробах какого-либо другого вида, т.е. являются видоспецифическими. Получается, что LUCA (last universal common ancestor), если он, действительно, был один, содержал на порядки больше генов, чем любой из его потомков, что, конечно, невероятно. (Ведь как образуются гены de novo, мы даже представить себе не можем).

Возможно, надежду на продвижение к ответу дают недавние результаты изучения внедрений палиндромов в гены риккетсий и вольбахий.

В составе геномов Rickettsia conorii и Wolbachia pipientis были обнаружены внедрения палиндромов трёх классов в последовательности различных генов. Палиндромы были названы RPE (Rickettsia specific palindromic elements) для рикеттсий и WPE (Wolbachia specific palindromic elements) для вольбахий. Последовательности одного из классов WPE не отличались от таковых RPE, тогда как WPE другого класса имели другой состав. Основные свойства этих палинромов сводились к следующему. Во-первых, палиндромы были кодирующими и детерминировали около 50 аминокислот. Во-вторых, они были мобильными. В-третьих, внедрения происходили без нарушений рамки считывания, и продукт гена не терял обычной функции. И, в-четвёртых, внедрения наблюдались в разных генах, кодирующих либо ферменты, либо поверхностные белки. Почему внедрения происходили без нарушений рамки считывания, объяснить трудно. Отсутствие нарушений функции продукта связано с тем, что новые аминокислоты оказывались в белковой петле, не имеющей отношения к функции поверхностного белка или работе активного центра фермента.

Таким образом, совокупность полученных фактов позволяет предположить, что именно такие события могли быть исходным материалом в процессе эволюционного формирования новых белков (9, 28, 29). Существенным затруднением для принятия такого механизма, как спасительного, для объяснения способа образования новых генов и их продуктов является то, что феномен обнаружен только у рикеттсий и вольбахий.

Присутствие повторов в геномах и патогенность бактерий.

Отмечены различия в представленности TR и SSR в геномах патогенных и непатогенных бактерий (12). Так, в геноме E.coli K12 вдвое меньше TR, чем в геноме клинического штамма E.coli O157:H7. В среднем количество TR всегда достоверно больше в геномах патогенных бактерий по сравнению с непатогенными (33). В свою очередь SSR, которым всегда отводится ключевая роль в адаптивных перестройках геномов патогенных бактерий (13) достаточно представлены в геномах бактерий таких родов, как Сlostridium и Haemophilus. В изученных случаях плотность SSR в геномах патогенных бактерий на 50% выше, чем в геномах непатогенных (33).

Итак, TR, SSR, и SPIDR присутствуют, преимущественно, в некодирующих, межгенных областях и влияют на работу регуляторных элементов. Наблюдается положительная корреляция между плотностью TR и SSR и патогенностью бактерий. CR имеет наименьший потенциал, как стимулятор рекомбинации, но обнаруживается преимущественно в составе генов, поэтому рекомбинация, стимулируемая CR, может быть наиболее эффективна как источник дупликации белок-кодирующих последовательностей. Все только что перечисленные повторы относятся к прямым. Обратные (IR) повторы гораздо реже встречаются в геномах бактерий. Образуя шпильки, они могут блокировать репликацию, транскрипцию и трансляцию.
Повторы в генах, ответственных за «обслуживание» генома и приобретение генетической информации.

Недавно обнаружилась ещё одна функция повторов. Обычно инвертированные повторы обнаруживались по всему геному у различных бактерий после кодирующих последовательностей, выполняя функции терминаторов транскрипции. Однако анализ геномов N.meningitidis, N.gonorrhoeae и H.influenzae выявил присутствие одиночных частей инвертированных повторов в составе генов. Дальнейшие исследования показали, что обнаруженные части повторов являются ничем иным, как сайтами интеграции фрагментов трансформирующей ДНК. Они были обозначены DUS (DNA uptake sequences). Последовательность DUS в составе генов нейссерий имеет вид: 5/-GGCCGTCTGAA-3/. Геном нейссерий содержит 1900 копий , а геном H.influenzae1471 копию DUS. Изучение распределения DUS в различных генах показало, что намного чаще DUS встречаются в генах, ответственных за процессы репарации, рекомбинации, рестрикции-модификации и репликации, чем в любых других генах (11). Остаётся неясным, почему вне генов DUS представлены в виде повторов, а внутри генов, как правило, в виде неповторяющихся последовательностей.

Причина преимущественного нахождения DUS в составе генов, ответственных за сохранение ДНК окончательно неясна, как неясны и механизмы, определяющие такое распределение и сохранение этих повторов. Предположение сводится к следующему. Гены репарации рекомбинации, рестрикции-модификации и репликации чрезвычайно важны для клетки. В случае их повреждения клетка может оказаться обречённой на гибель. В неблагоприятных стрессовых условиях, значительная доля микробной популяции, действительно, погибает. Однако меньшая доля клеток, имеющая в составе самых существенных генов DUS, будет в состоянии приобрести неповреждённые копии этих генов из лизатов погибших клеток за счёт трансформации. Такой механизм восстановления существенных генов незаменим во всех случаях, когда нарушается целостность генома, будь то мутации, или потеря генов за счёт делеций.

Итак, DUS способствуют приобретению участков ДНК (предположительно утраченных ранее или повреждённых) в бактериях природно-трансформабельных видов. Роль DUS в горизонтальном переносе пока не определена. Известно, однако, что механизм горизонтального переноса использует организованные инвертированные повторы в составе сайтов интеграции интегронов и сайтов, сцепленных с генами тРНК (см. 2). В указанных случаях повторы играют положительную для приобретения генетического материала роль.

Относительно недавно была открыта противоположная роль повторов. Она заключается в ограничении ассимиляции геномами бактерий и архей ДНК, поступающей извне. Эта система ограничения довольно сложна, является многокомпонентной и, с одной стороны имеет черты систем рестрикции-модификации, а с другой – черты иммунной системы. При этом иммунитет работает без участия принципа белок-белкового узнавания. Основу этой системы составляют повторы CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) (18, 19, 6, 25, 26 40).
CRISPR были открыты в геноме Escherichia coli в 1987 году (17). Они присутствуют в геномах примерно 40% бактерий и 90% архей. Сейчас очевидно, что CRISPR являются основной частью сложной системы защиты хозяина от проникновения (и ассимиляции) постороннего генетического материала. Система устроена следующим образом (Рис. 4). Каждый CRISPR локус состоит из палиндромных повторов размером 21 или 48 п.о., разделенных неповторяющимися спейсерами от 26 до 72 п.о. Обычно CRISPR локус содержит около 20 повторов, но их количество может достигать 300. Обычно бактериальные или архейные геномы содержат около 18 CRISPR локусов. В плазмидах CRISPR локусы встречаются редко. Очень важным оказался факт 100% гомологии спейсеров с геномами бактериофагов или плазмид. На этом основании было сделано заключение о том, что спейсеры – это части фаговых или плазмидных геномов. Обычно CRISPR сцеплены с генами cas (CRISPR associated sequences). Гены cas кодируют нуклеазы, геликазы и ДНК-связывающие белки. Перед первым CRISPR повтором находится промотор. CRISPR локус обычно транскрибируется в том же направлении, что и прилежащие гены cas.

Поступающая в бактериальную клетку фаговая или плазмидная ДНК подвергается атаке cas-нуклеаз. Образовавшийся фрагмент(ы) встраивается в проксимальную область одного или нескольких CRISPR локусов, образуя первый спейсер. Внедрение нового спейсера иногда сопровождается исключением одного из внутренних спейсеров. Это происходит за счёт гомологичной рекомбинации можду фланкирующими внутренний спейсер повторами. Теперь выжившие клетки несут в CRISPR локусе часть фагового или плазмидного генома, и являются иммунными к повторному заражению данным фагом или плазмидой. Если такое заражение происходит, имеет место следующая последовательность событий. CRISPR-транскрипт подвергается атаке cas-нуклеаз, образуются мелкие crРНК. Эти РНК связываются с поступившей в клетку чужеродной фаговой или плазмидной ДНК. При этом связывание происходит как с сенс-, так и с антисенс-цепями. Образовавшиеся ДНК-РНК гибриды подвергаются атаке cas-нуклеаз, что приводит к их инактивации. Установлено, что в некоторых видах бактерий и архей CRISPR- cas система может атаковать не только ДНК, но и мРНК. Важно отметить существование специфичности во взаимодействии CRISPR локусов и cas-нуклеаз: cas-ферменты активны только относительно «своих» CRISPR. Один из генов cas отвечает за внедрения новых спейсеров, а другие – за формирование устойчивости к чужеродной ДНК.

Хотя в целом организация и работа этой сложной системы понятны, многие её детали ещё предстоит выяснить. Так, например, неизвестна природа специфичности механизма, внедряющего вновь поступивший в бактерию фрагмент чужеродной ДНК на место проксимального спейсера. Целесообразность этого механизма очевидна. Проксимальный спейсер транскрибируется намного эффективнее, чем дистальные. Поэтому напряжённость иммунитета будет гораздо выше относительно ДНК, вошедшей в клетку последней, чем относительно ДНК, проникавшей в бактерию раньше. То есть бактерия защищает себя от «сегодняшней» угрозы активнее, чем от угрозы «позавчерашней». Неизвестна также природа специфичности cas-нуклеаз относительно «своих» CRISPR локусов. Неясна и природа сигнала, активирующего рекомбинацию, которая приводит к удалению одного из внутренних CRISPR-повторов в CRISPR локусе в ответ на внедрение нового проксимального спейсера.

Возможно, именно присутствие CRISPR- cas системы в геномах большинства видов архей обеспечило относительную гомогенность размеров их геномов. Непонятной остаётся причина, по которой 90% архей унаследовали и закрепили систему CRISPR-cas, тогда как у бактерий эта система наличествует только в 40% случаев.

Будучи предназначенными для ограничения горизонтального переноса генетического материала, сами CRISPR локусы могут передаваться горизонтально с помощью плазмид или фагов. Их интеграции в геном способствуют фланкирующие IS-элементы.

Экспериментальные данные, суммированные в данной работе, определённо указывают на существование в геномах бактерий сайтов, предназначенных для ассимиляции чужеродной ДНК. Это интегроны, сайты интеграции, сцепленные с генами тРНК, сайты интеграции ДНК умеренных бактериофагов, элементы DUS. Все без исключения сайты интеграции образованы повторами. Эти сайты существуют не сами по себе, а являются частями очень специфических и сложных генетически детерминированных механизмов, направленных на поглощение ДНК извне и её ассимиляцию геномами-реципиентами. В результате в геномы-реципиенты внедряются участки чужеродной ДНК от фрагментов «чужих» генов до геномных островов и целых геномов умеренных фагов. Наряду с этим, повторы образуют и другие системы (CRISPR-cas), направленные на ограничение ассимиляции геномами ДНК, поступившей извне. И это не единственный способ защиты. Вспомним классические системы рестрикции-модификации.

Таким образом, в ходе эволюции сформировались противоположно направленные системы, одна группа которых способствует приобретению новой ДНК геномами, а другая ограничивает этот процесс. Что обеспечивает баланс между этими силами абсолютно неизвестно.

Повторы в генах стрессовых реакций.
В природе бактерии часто оказываются в условиях стресса (температура, осмотическое давление, рН, наличие питательных веществ, присутствие токсических соединений). Эти условия могут быть очень разными и по своей сути, и по продолжительности воздействия. Короткие воздействия микроб переживает, включая набор генов стрессовых реакций (ГСР). Эта стратегия базируется на модификации транскрипции ряда генов и выключении одних, обычно работающих, и включении в норме молчащих генов. При длительных и сильных стрессовых воздействиях для выживания требуются другие механизмы.

В таких случаях выживают не все члены микробной популяции, а только те, которые претерпели существенные изменения своих геномов и образовали клоны, устойчивые к данному виду стресса. Образованию таких клонов должно предшествовать и способствовать возникновение геномной гетерогенности и, как следствие, фенотипического разнообразия в популяции. Мы уже знаем, что геномная гетерогенность достигается за счёт тех или иных генетических перестроек, в основе которых лежит незаконная рекомбинация. Частоты рекомбинации, в свою очередь, прежде всего, зависят от наличия, локализации и типов нуклеотидных повторов. Рассмотрим, существует ли взаимосвязь, между распределением повторов в геномах и ГСР.

Были изучены около 300 генов E.coli, имеющих отношение к репарации, рекомбинации и адаптации к стрессу. Оказалось, что в ГСР почти отсутствуют протяжённые повторы, способствующие гомологичной рекомбинации. Однако CR, вызывающие проскальзывание репликации, присутствуют в ГСР в избыточных количествах.
Наряду с ГСР, предпочтительными для расположения повторов являются гены прямо или косвенно участвующие в переносе и наследовании генетической информации, т.е. участвующие в метаболизме ДНК. Примерами таких генов можно, считать гены мутаторы и гены, ответственные за рекомбинационные события. Гены мутаторы mutL и mutS содержат избыточное количество близких прямых повторов. Повторы стимулируют образование мелких делеций, которые приводят к выраженному мутаторному эффекту.

В гене sbcC также присутствует избыточное количество близких прямых повторов, а ген sbcВ –тетрануклеотидных SSR, стимулирующих незаконную рекомбинацию. Белок SbcCD расщепляет шпилечные структуры, замедляющие продвижение репликативной вилки, что позволяет рекомбинации восстановить работу репликативного комплекса. Поэтому нарушения структуры генов sbc приведёт к нарушению метаболизма ДНК.



Отмечена также большая плотность повторов в генах супероксиддисмутаз. В гене sodB увеличено количество CR, в гене sodА – мононуклеотидных SSR, а в гене sodС – тетрануклеотидных SSR. Эти гены кодируют разные супероксиддисмутазы и необходимы для борьбы клетки с кислородным стрессом. Более того, мутации в генах sodА и sodВ могут приводить к мутаторному эффекту (34).
На мой взгляд, очень важным является то обстоятельство, что повторы распределены не равномерно и не случайно не только в составе геномов, но и в составе генов. Более того, разные гены имеют различные предпочтительные сайты для образования повторов. Так, в генах mutL и sbcC повторы расположены равномерно по всей длине. По краям гена dnaA и в конце гена aceF вообще нет повторов. А в гене sodB повторы распределены очень неравномерно. Есть различия и в количестве копий повторов в зависимости от гена. Например, в генах mutL и sbcC повторы присутствуют в виде одиночных копий, а в генах csgA и aceF присутствуют множественные повторы различных типов (34). Такие различия в присутствии повторов в тех или иных участках определённых генов свидетельствуют о том, что образование и, как следствие, распределение повторов является зависимым от контекста.
Итак, гены стресса, гены, ответственные за перенос и приобретение генетической информации и гены, важные для «обслуживания» генома, содержат избыточное, по сравнению с другими генами, количество тех или иных повторов. На первый взгляд это, как минимум, странно, так как следовало бы ожидать, что столь важные гены должны быть максимально консервативными. Тогда в ходе эволюции повторы должны были бы исчезнуть из таких генов.
Однако возможна и другая стратегия: перестраховка на случай непредвиденных обстоятельств. По принципу: «Не клади все яйца в одну корзину». Такими непредвиденными обстоятельствами могут быть разнообразные условия и факторы стресса. Если отдельная клетка исповедует такую стратегию она и, во всяком случае, её потомство, в стандартных условиях проигрывает, так как возможные перестройки важных генов, скорее всего, приведут к катастрофе. Однако в нестандартных условиях, когда наступают «тяжёлые времена», в выигрыше окажется популяция, содержащая полиморфные клетки с разным потенциалом противодействия. Тогда у части таких клеток выше шансы выжить и дать начало клону, приспособленному к новым условиям. Если такая гипотеза верна, то накопление повторов в генах, существенных для «обслуживания» генома, становится целесообразным. Пока строгих экспериментальных данных в пользу или против этой гипотезы нет.

Повторы и способность бактерий к движению.

Ряд внутриклеточных бактерий, куда входят Listeria monocytogenes, Shigella spp., возбудитель пятнистой лихорадки Rickettsia spp., и вирус осповакцины зависят от собственной способности к движению. Движение необходимо бактериям для передвижения внутри эукариотической клетки и для распространения в тканях между клетками. Эта способность полностью определяется генетически детерминированными механизмами полимеризации и деполимеризации актина. Ключевую роль в этих процессах играет белок ActA.

У листерий трансмембранный белок ActA состоит из 639 аминокислот и не имеет аналогов среди известных белков. Белок ActA содержит 2 типа повторов (Рис. 5). Меньшие из них состоят из 11 аминокислот. В центре находятся 3 или 4 пролина, окружённые несколькими кислыми аминокислотами. Эти повторы были обозначены PRR (proline rich repeats). Консенсус аминокислотной последовательности PRR имеет вид DFPPPPTDEEL. (Естественно, соответствующие нуклеотидные повторы представлены в геноме).

Каждый PRR отделён от другого повтора одним из 3-х типов спейсеров, называемых длинные повторы. Два типа спейсеров гомологичны между собой и содержат 24 аминокислоты, третий тип спейсеров не гомологичен первым двум и содержит 33 аминокислоты. Для обеспечения полимеризации-деполимеризации актина кроме бактериального белка ActA на первых этапах необходимы два белка эукариотической клетки: профилин и фосфопротеин VASP. Установлено, что PRR связывают VASP и определяют локализацию профилина на поверхности бактериальной клетки. Существует прямая линейная зависимость между количеством PRR и скоростью движения бактерий. Спейсеры, (названные авторами длинные повторы), детерминируют механизм движения, независимый от PRR, VASP и профилина. В результате было установлено, что ActA-индуцируемая полимеризация актина не зависит от PRR, инициация движения требует наличия спейсеров и белка ActA и что скорость движения бактерий зависит от количества PRR. Каждый PRR добавляет к скорости 2-3 µm/мин (39).


Об эволюции многокомпонентных генетических систем

Бактерии обладают только частью генов, обеспечивающих все необходимые для движения функции. Недостающие функции они «заимствуют» от эукариотической клетки-хозяина. Нужно сказать, что заимствовать есть, что. Процесс нуклеации, полимеризации и сшивания актина требует активности десятков белков и, соответственно, кодирующих их генов. Следует отметить, что бактерии разных видов «перехватывают» энзиматические активности эукариотических каскадов на разных этапах. Это значит, что бактерии каждого вида эволюционировали независимо и конвергентно с целью использовать генетические детерминанты эукариотических клеток-хозяев. Остаётся очевидным, что у бактерий, и, тем более, у эукариотических клеток способность к движению детерминирована многими генами (см.16).

Когда мы говорим о многокомпонентных системах (где количество компонентов равно двум или более), возникает вопрос об их эволюционном происхождении. В данной работе в качестве таких систем были представлены система ограничения ассимиляции чужеродной ДНК CRISPR-cas и система, обеспечивающая движение бактерий ActA-VASP/профилин. Ранее рассматривались многокомпонентные бактериальные системы, обеспечивающие антигенную вариабельность и сайт-специфические рекомбинационные процессы (1, 2). Понятно, что когда речь идёт об эволюционном происхождении многих генов, которые в будущем должны составить систему, требуемые для образования системы временные рамки многократно расширяются. Вероятно, они должны измеряться как минимум миллионами лет. То есть, со времени возникновения первого гена, как компонента системы, до формирования всей системы в целом должен пройти геологический отрезок времени. В наше время многокомпонентные системы наследуются в виде модулей т.е. en bloc, чему способствует сцепленность генов, кодирующих соответствующие компоненты. Если бы эти гены не были сцеплены, то для того, чтобы собрать всю систему (например, при горизонтальном переносе) потребовалось бы переносить каждый ген отдельно. Скорее всего, вероятность сборки многокомпонентной системы в одном реципиенте в этом случае была бы близкой к нулю. Хотелось бы понять, как такие системы могли возникнуть изначально. В этом случае проблема усложняется, так как перед тем, как быть собранными, соответствующие гены должны были быть образованы и закреплены отбором по отдельности, поскольку все вместе они образоваться не могли. Ведь согласно СТЭ в геномах должны сохраняться только те детерминанты, которые кодируют признаки, поддерживаемые естественным отбором. Первый, второй и следующий гены и другие модули будущей системы до тех пор, пока не сформировалась вся система в целом, не должны быть востребованы, а значит, согласно СТЭ, должны быть удалены из генома «за ненадобностью». Видимо, этого не происходит. Единственный выход из сложного положения состоит в том, что ещё до включения в многокомпонентную систему каждый её будущий член выполнял какую-то полезную функцию. Хотя именно этот аргумент используется большинством коллег, сторонников СТЭ, мне он представляется неубедительным до тех пор, пока не будет твёрдо доказан для каждого из многих генов и других модулей, составляющих ту или иную многокомпонентную систему.


Заключение.

Только в последнее время в официальной научной печати стали появляться признания того, что мы не знаем, как исходно могли появиться гены (29).

Нам понятно, что путём дупликаций (и последующих изменений одной из копий) «своих» генов можно создать что-то новое, но на старой основе. Нам понятно, что гены, перенесённые горизонтально, могут обогатить геном реципиента. Но это не новые гены. Это уже существовавшие гены.

Сейчас мы твердо знаем, что не существует фундаментального генетического процесса, который так или иначе, не обеспечивался бы повторами. Более того, мы видим, что не только онтогенез, но и эволюционные изменения происходят благодаря повторам. И, наконец, мы видим, что те гены, которые должны быть самыми стабильными в силу своей значимости, на самом деле, буквально «напичканы» повторами «на всякий случай». Предположительно такими случаями являются те или иные условия стресса. Конечно, это положение не могло сложиться случайно, однако, остаётся непонятным, на что ориентирован естественный отбор, сохраняющий повторы в «мирный период». Скорее всего, общепринятый естественный отбор в данном случае вообще не играет роли, поскольку применительно к некодирующим повторам нет фенотипического признака, который можно отбирать с помощью условий внешней среды. Я думаю, что распределение повторов в геномах зависит от нуклеотидного контекста и в то же время определяет будущий контекст геномов (2). Очевидным остаётся то, что в определённых сайтах определённых геномов присутствуют определённые повторы, которые могут изменять свою кратность и позицию в геноме. Именно эти параметры наличия и распределения повторов и определяют функционирование геномов.

На основании изложенных материалов можно заключить, что повторяющиеся последовательности обеспечивают две сущности геномов.

Первая и относительно хорошо изученная определяет функционирование генома в течение всего жизненного цикла любой клетки. Здесь повторы детерминируют регуляцию активности отдельных генов и ход генетических процессов, таких как репликация, транскрипция, трансляция. Эти процессы происходят по заданному плану, регулярно, в течение каждого клеточного цикла. При нормальных условиях существования вероятность таких событий 100%. Повторы, обеспечивающие регуляцию, создают функциональный «портрет» генома на данный момент.

Вторая сущность геномов изучена мало. Здесь повторы детерминируют вероятность рекомбинации и делеций-дупликаций при проскальзывании репликации. При этом речь идёт обо всех известных видах рекомбинационных событий – гомологичной, незаконной, сайт-специфической рекомбинациях. В основном, это межгенные прямые повторы. Однако в случаях сайт-специфической рекомбинации в большинстве случаев работают инвертированные повторы. Повторы, обеспечивающие рекомбинацию, детерминируют структуры вероятных геномов, которые могут с неопределённой вероятностью образоваться в будущем. Эти геномные «портреты» не очевидны, так как расположены в будущем и вероятности их образования определяются многочисленными свойствами повторов.

Таким образом, с помощью повторов в геноме детерминированы его действующая в данный момент сущность и вероятный будущий «портрет».

Благодарность. За интерес, проявленный к работе, и ценные замечания автор приносит глубокую благодарность М.С. Покровской, В.Ю. Литвину, В.Л. Мотину и Р. Нудельману.

Литература



  1. Смирнов Г.Б. //ВНИИМИ. Медицина и здравоохранение,сер. Эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания. - Вып. 3, М.- 1988- С.1.



  1. Смирнов Г.Б. // Успехи современной биологии – 2008 – Т 128, №1 – С. 52-76.



  1. Achaz G., Rocha E. P. C., Netter P. and Coissac E. // Nucleic Acids Research – 2002- Vol. 30, N. 13 - P. 2987-2994.



  1. Aras R. A., Kang J., Tschumi A. I., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2003 - Vol. 100, N. 23 – P. 13579-13584.



  1. Bi, X. and Liu, L.F. //Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. – 1996 – V. 54 – P. 253–292.



  1. Barrangou R., Fremaux C, Deveau H., et al. // Science – 2007- N. 315 – P. 1709-1712.



  1. Brinig M. M., Cummings C. A., Sanden G. N., et al. // Journal of Bacteriology – 2006 - Vol. 188, N. 7 - P. 2375-2382.



  1. Chédin, F., Dervyn, E., Ehrlich, S.D., and Noirot, P.// Mol. Microbiol. – 1994 - N 12 - P. 561569.

  2. Claverie J.M, and Ogata H. // Trends Biochem Sci. – 2003 – Vol.28, N.2 – P. 75-80.
  3. Cole S. T.,. Eiglmeier K, Parkhill J., et al. // Nature – 2001 – N. 409 - P. 1007-1011.


  4. Davidsen T., Rødland E.A., Lagesen K., et al. // Nucleic Acids Research – 2004 - Vol. 32, N. 3 – P. 1050-1058.

  5. De Bolle, X., Bayliss, C.D., Field, D., et al. // Mol. Microbiol. 2000.35: 211–222.

  6. Deitsch, K.W., Moxon, E.R., and Wellems, T.E. // Microbiol. Mol. Biol. Rev.1997 - Vol.61 - P. 281293.

  7. Eckert, K.A. and Yan, G. // Nucleic Acids Res.2000 – Vol. 28 – P. 28312838.



  1. Fetherson J.D., Schuetze P., and Perry R.D.// Molec. Microbiol. – 1992 – Vol. 6 – P. 2693-2704.



  1. Goldberg M. B. // Microbiology and Molecular Biology Reviews - 2001 - Vol. 65, N. 4 P. 595-626.



  1. Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., et al. // J. Bacteriol. – 1987 –Vol. 169, N12 – P. 5429–5433.



  1. Jansen, R., van Embden, J.D., Gaastra, W., and Schouls, L.M.// OMICS - 2002 - Vol. 6 – P. 2333.

  2. Jansen R., Embden J.D., Gaastra W., and Schouls L.M.//Mol Microbiol. – 2002 – Vol. 43, N6 – P. 1565-75.

  3. Koonin E. V; Wolf Y.I. // Nucleic acids research – 2008 – Vol.36, N21 – P. 6688-6719.



  1. Levinson, G. and Gutman, G.A.. //Mol. Biol. Evol. - 1987 – Vol. 4 – P. 203–221.



  1. Lovett, S.T., Gluckman, T.J., Simon, P.J., et al.. // Mol. Gen. Genet. - 1994 – Vol. 245 – P. 294–300.



  1. Mahillon, J. and Chandler M. // Microbiology and Molecular Biology Reviews. – 1998 - Vol. 62, N. 3 – P. 725-774.



  1. Maniloff, J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1996 – Vol. 93 – P. 10004–10006.

  2. Marraffini L.A, and Sontheimer E.J. // Science. - 2008 – Vol. 19, N.322 (5909) – P. 1843-1854.

  3. Mojica F. J. M., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J and Almendros C. // Microbiology - 2009 – Vol. 155 – P. 733-740.

  4. Nierman, W. C., De D. Shazer, H. S. Kim, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 2004 - Vol. 101 – P. 14246-14251.

  5. Ogata H, Audic S, Abergel C, et al. // Genome Res.2002 – Vol. 12 – P. 808-816.

  6. Ogata H., Suhre K. and Claverie J.-M. // TRENDS in Microbiology - 2005 - Vol.13, N.6 – P. 253-254.

  7. Peeters, B.P., de Boer, J.H., Bron, S., and Venema, G. // Mol. Gen. Genet. – 1988 Vol. 212 – P. 450–458.



  1. Pierce, J.C., Kong, D., and Masker, W. // Nucleic Acids Res. – 1991 – Vol. 19 – P. 3901–3905.



  1. Rocha E. P. C. and Blanchard A. // Nucleic Acids Research. – 2002 - Vol. 30, N. 9 – P. 2031-2042.

  2. Rocha E.P.C. // Genome Res. - 2003 – Vol. 13 – P. 1123-1132.

  3. Rocha E. P. C., Matic I., and Taddei F. // Nucleic Acids Res. - 2002 – Vol. 30, N.9 – P. 1886–1894.



  1. Rocha Е.P.C., Danchin A., and Viari A. // Molec. Biol. And Evolution. – 1999 – Vol. 16, N.9 – P. 1219-1230.



  1. Romero, D. and Palacios R. // Annu. Rev. Genet. – 1997 – Vol. 31 – P. 91-111.



  1. Roth, J. R., Benson N., Galitski T., et al. // In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, edited by R. C. H. Neinhardt, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. Brooks Low, B. Magasanik et al. ASM Press, Washington, DC. – 1996 – P. 2256–2276.



  1. Smith, G. R. // Microbiol. Rev. – 1988 – Vol. – 52 - P. 1-28.



  1. Smith G. A., Theriot J. A., and Portnoy D. A. // The Journal of Cell Biology. - 1996 – Vol.135, N. 3 – P. 647-660.

  2. Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P. // Nat Rev Microbiol. – 2008 – P. 6, N.3 – P.181-186.

  3. Tobes R., and Pareja E. // BMC Genomics – 2006 – Vol. 7 – P.62.



  1. Trinh T.Q. and Sinden, R.R. // Nature – 1991 – Vol. 352 – P. 544547.



  1. Trivedi S. // Genet. Mol. Res. – 2006 – Vol. 5, N.4 – P. 741-772.

  2. van Belkum, A., Scherer, S., van Alphen, L., and Verbrugh. H. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1998 – Vol.62, N.2 – P. 275–293.

  3. Waters E.,M.J., Hohn I., Ahel D.E., et al. // Proc. Natl.Acad. Sci. U S A. – 2003 - Vol.100 - P.12984-12988.

  4. Woese С. R. // Microbiol Rev. – 1987 - Vol. 51, N 2 - P. 221—271.







©netref.ru 2017
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет