Исследование апоптоза тимоцитов крысы под воздействием ультрафиолетового и  -излучения.



бет1/3
Дата19.08.2020
өлшемі0.76 Mb.
түріИсследование
  1   2   3
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биофизики клетки

 

 



На правах рукописи

УДК 577.125

  

ВЕЛИКИЙ МОГУЧИЙ ВЛАДАН

 

 

Исследование апоптоза тимоцитов крысы под воздействием ультрафиолетового и -излучения.



(направление 510600 - биология)

Диссертация на соискание ученой степени

магистра биологических наук

 «Работа допущена к защите»



Научный руководитель________________________________проф. Такой-то

Руководитель магистерской программы_________________проф. Тот же самый

 

 



Солнечный город на Оке

2001
Оглавление

Введение_________________________________________________________________3

Глава 1. Обзорная часть____________________________________________________4

1.1 Общие сведения об апоптозе__________________________________________4

1.2 Различие взглядов на природу явления апоптоза__________________________5

1.3 Действие ионизирующих излучений на клетки___________________________5

1.4 Молекулярные механизмы апоптоза___________________________________7

1.5 Взаимосвязь репарации и апоптоза____________________________________8

1.6 Молекулярный и генетический контроль апоптоза_______________________11

Глава 2. Материалы и методы исследований_________________________________14

2.1 Использовавшиеся в экспериментах реагенты__________________________14

2.2 Инкубация клеток__________________________________________________14

2.3 Облучение клеток УФ- и гамма-радиацией_____________________________14

2.4 Методы измерений. Проточная цитометрия___________________________15

2. 4.1 Измерение проницаемости плазматической мембраны клеток________________15

2.4.2 Измерение содержания ДНК________________________________________17

2.5 Ингибиторный анализ_______________________________________________18

2.5.1 Протеинкиназы С, А, тирозиновая, фосфолипаза А2________________________18



2.5.2 Липооксигеназный и циклооксигеназный пути окисления арахидоновой кислоты___19

Глава 3. Результаты и обсуждение___________________________________________21

3.1 Исследование биохимических механизмов индукции апоптоза

тимоцитов крысы при различных воздействиях_____________________________21

3.2 Действие УФ-облучения на тимоциты крысы___________________________22

3.3 Действие гамма-облучения___________________________________________26

Глава 4. Выводы___________________________________________________________30

Литература________________________________________________________________31

Список сокращений________________________________________________________38

Введение

Апоптоз имеет общебиологическую значимость; иммунная система представляет собой лишь один из наиболее важных полигонов для его проявления. Это определяет структуру настоящего обзора: сначала будут представлены основные сведения о феноменологии и механизмах данного явления преимущественно на примере гибели лимфоцитов, а затем мы рассмотрим проявления апоптоза в процессе созревания и функционирования клеток иммунной системы. Отметим, что этому чрезвычайно бурно развивающемуся направлению науки посвящены многочисленные обзоры, опубликованные в последние 2-3 года, и что данная проблематика привлекала внимание отечественных исследователей, особенно радиобиологов, задолго до завоевания ею всеобщей популярности (первый обзор по апоптозу на русском языке был опубликован в самом начале 80-х годов.

Апоптоз изучают около 25 лет, в последние 10 лет его изучение стало более интенсивным. Оно знаменуется переходом от морфологического уровня к биохимическому и генетическому. В соответствии с мировыми тенденциями, в настоящей работе была предпринята попытка определить, какие из ферментов внутриклеточной сигнализации участвуют в индукции и подавлении апоптоза тимоцитов крысы коротковолновым ультрафиолетовым (УФС) и гамма-излучениями. Феномен апоптоза является результатом действия различных факторов, приводящих к гибели клетки. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, g- и УФ-излучение, бактериальные токсины и др. Во всех этих случаях происходит индукция апоптоза, но при увеличении дозы соответствующего агента развивается некроз клетки. Поскольку апоптоз физиологическое явление, то в организме должны быть факторы, приводящие к апоптозу клетки.

Цель настоящей работы заключалась в выявлении и изучении закономерностей индукции и осуществления апоптоза в тимоцитах крыс линии Вистар под воздействием ультрафиолетового и -облучения в зависимости от влияния на них других факторов. Для этого предполагалось выполнить следующие задачи:

Исследовать кинетику развития УФ-индуцированного апоптоза в тимоцитах крыс при воздействии на них афидиколина, 3-аминобензамида, актиномицина Д и циклогексимида;

Выяснить дозовую зависимость апоптоза в клетках под совместным и одиночным влиянием дексаметазона, ультрафиолета и -облучения, а также при действии Н-7 и форболмиристат ацетата.



Глава 1. Обзорная часть.

1.1. Общие сведения об апоптозе.

Гибель клеток - необходимый процесс в жизни любого многоклеточного организма, направленный на удаление уже не нужных организму клеток при дальнейшем развитии в случае программируемой клеточной гибели (пкг), или из-за необходимости удаления поврежденных клеток при апоптозе и некрозе. Тот или другой путь обусловлен силой повреждения. Различают программируемую клеточную гибель, апоптоз и некроз [7]. Наибольший интерес у исследователей вызывает апоптоз. Апоптоз, приводя к гибели отдельной клетки, решает проблему поддержания функциональных свойств популяции. Апоптоз изучают около 25 лет, в последние 10 лет его изучение стало более интенсивным. Оно знаменуется переходом от морфологического уровня к биохимическому и генетическому. Выявляются параллели апоптоза с процессами канцерогенеза и их деструкции [43]. Апоптоз проявляется в биологических процессах, таких как дифференцировка, развитие, клеточное созревание и в иммунологических функциях при воздействии повреждающих агентов (физических и химических). Он наблюдается в тимоцитах при воздействии глюкокортикоидов (дексаметазона). Три аспекта исследования рака связаны с понятиями апоптоза: онкогенез, гомеостаз опухоли [15] и механизм действия цитотоксических агентов. Признаками апоптоза являются: заметная конденсация и маргинация хроматина с клеточным сморщиванием; за ними следуют ядерная фрагментация, изменение клеточной поверхности и секвестирования клеточных веществ в апоптотические тельца. При апоптозе отмечается компактизация хроматина в узкие, шнуроподобные плотные массы, которые граничат с ядром [78]. В цитоплазме развивается конденсация, затем наступает инволюция ядра. Ядра часто разрываются и образуют отдельные фрагменты. На клеточной поверхности возникают выступы и впячивания. Затем образуются апоптозные тельца различного размера с плотно упакованными органеллами [18]. Апоптозные тельца содержат либо по одному, либо большее количество ядерных фрагментов, в которых ядерный хроматин распределен серповидными частицами по периферии. Клеточная конденсация, которая характеризует апоптоз, коррелирует с увеличением плотности, это делает возможным отделить апоптозные тела центрифугированием [37].

Механизм конденсации систематически до сих пор не изучался. Мало известно и о цитоскелетных изменениях. Быстрый фагоцитоз апоптозных тел иллюстрирует изменения в плазматических мембранах [22]. Недавно был выявлен vitronectin рецептор, гетеродимер, принадлежащий к семейству цитоадгезивных интегринов, который вовлекается в распознавание апоптозных нейтрофилов и лимфоцитов макрофагами. Степень ядерной фрагментации для разных типов клеток различается [6]. Для клеток с высоким ядерно-цитоплазматическом соотношением, таких как тимоциты, число фрагментов ограничено. В тканях апоптозные тельца быстро захватываются соседними клетками [32], где перевариваются лизосомами. Конденсация и почкование, в результате которых формируются апоптозные тельца, происходят в несколько минут [14]. In vivo фагоцитоз и переваривание наблюдаются быстро: апоптозные тельца остаются видимыми в световой микроскоп в течение нескольких часов [17]. Этот процесс можно наблюдать гистологически. Иначе проявляются признаки некроза [5]. Ранние изменения обусловливаются повреждением мембран или угнетением АТФ и расстройством активности мембранного насоса. Точка необратимости  увеличение мембранной проницаемости [65], которая может быть объяснена активацией мембраносвязанных фосфолипаз за счет увеличения содержания кальция. На поздней стадии ядерный хроматин распадается [49], что называется кариолизисом. Некроз наблюдается in vivo и обычно сопровождается воспалением и, если вовлечено большое количество клеток, образуется рубец [12]. Имеет свои особенности и программируемая клеточная гибель.

У многоклеточных организмов именно апоптоз поддерживает гомеостаз тканей вследствие сохранения баланса между пролиферацией и отмиранием клеток (Meikrantz et al.). Утеря способности клеток к нормальной физиологической гибели наряду с бласттрансформацией создает условия для накопления неполноценных ических ростовых факторов. Апоптоз, или программируемая клеточная гибель, лежит в основе таких важных биологических процессов, как позитивная и негативная селекция Т- и В- лимфоцитов [26], индуцированная глюкокортикоидами, гибель клеток, вызванная облучением [31], нагреванием или отсутствием играет важную роль в защите организма при вирусных инфекциях. Иммунодефицит при ВИЧ-инфекции определяется нарушениями в контроле апоптоза [52].

1.2. Различие взглядов на природу явления апоптоза.

К настоящему времени известно, что апоптоз могут вызывать как внутриклеточные сигналы, так и внешние, опосредующие свое действие через рецепторные системы, которые сами по себе не являются токсическими или деструктивными. Существуют два взгляда на природу механизмов, запускающих апоптоз [67]. Согласно одному из них, в клетках предсуществуют генетическая программа и готовый механизм реализации гибели и индукторы апоптоза деблокируют эти программу и механизм. Согласно другой точке зрения, механизм гибели клеток происходит вследствие аберрантной реализации сигнальных механизмов [90], в норме приводящих к осуществлению активации или дифференцировке клеток. Изложенное выше объясняет интерес исследователей к изучению генетического контроля и механизмов сигнализации при развитии апоптоза [63].

Многочисленные исследования процессов, происходящих в клетках иммунной системы (тимоцитах и Т-лимфоцитах), развернувшиеся в последнее время [74], посвящены механизмам активации Т-лимфоцитов и апоптозу тимоцитов, вызываемому как естественными механизмами селекции, так и возникающими после воздействия различных повреждающих факторов [81]. Достаточно хорошо изучен апоптоз при воздействии глюкокортикоидных гормонов и гамма-радиации [85].

1.3. Действие ионизирующих излучений на клетки.

Интерес исследователей к ультрафиолетовому облучению весьма разнообразен. От чисто прикладных работ, посвященных действию солнечного света на кожу человека, до фундаментальных исследований УФ-индуцированных повреждений ДНК и действию на систему ключевых ферментов [79]. Объекты исследований также весьма различны: E-coli, кератиноциты, иммунокомпетентные клетки, клетки печени, различные вирусы и т.д.

Апоптоз, протекающий в облученных или обработанных глюкокортикоидами тимоцитах характеризуется прежде всего ядерными изменениями, сопровождающимися внутринуклеосомальным разрезанием в линкерной области ДНК [14]. Долгое время было распространено мнение, что процесс запускается изменением содержания внутриклеточного Са2+ и вызываемым им усилением эндонуклеазной активности, что сопровождается изменениями в синтезе РНК и белков [3]. Сопоставление результатов исследований in vivo и in vitro на различных клеточных линиях привели к изменению этой системы представлений [21].

Проточная флюорометрия сделала возможным проследить деградацию ДНК в индивидуальных клетках [34]. Было найдено, что фрагментация хроматина наблюдается через 1-2 ч после облучения и достигает максимума через 8-10 ч [86]. ДНК распадается в каждой клетке очень быстро и кинетика фрагментов отражает постепенное вовлечение лимфоцитов в процесс апоптоза. Было найдено, что соотношение мононуклеосом к олигомерам различной длины не зависит от дозы или времени, прошедшего после облучения (Umansky, 1991).

Фрагментация двойных нитей ДНК наблюдается в лимфоцитах и линиях клеток, из них происходящих; в других типах клеток, таких как Hela, C3H-10T1/2 фрагментации нет (Tomei, 1991). Возможно, что в них различна роль Са2+-зависимых и Са2+-независимых эндонуклеаз и синтеза de novo РНК и белка [76].

Эксперименты показывают, что ингибирование синтеза белка, блокирующее апоптоз, допускает двойное толкование: 1) молекулы, требуемые для гибели, могут всегда существовать в клетке при наличии очень короткого времени жизни; 2) они могут быть синтезированы при трансдукции сигнала о клеточной гибели [51].

Тот факт, что апоптозу препятствуют ингибиторы синтеза белка, свидетельствуют о его активной природе. Но циклогексимид подавляет апоптоз не во всех случаях. Он блокирует естественный апоптоз в цитотоксических тимоцитах, а также апоптоз, возникающий при гипертермии или при введении глиотоксина. Циклогексимид сам индуцирует апоптоз в быстро пролиферирующих клеточных популяциях [67]. Возможно, что синтез белков существенен для инициации апоптоза при стимулах некоторого типа, но не является абсолютно необходимым для выполнения процесса. С другой стороны циклогексимид не может полностью оборвать синтез белков.

Выяснено, что при апоптозе:

1) транскрипционная система синтеза белков целиком или специфически ингибирована;

2) количество лизосомальных ферментов увеличено, хотя недостаточно аргументов к тому, что это ведет к клеточной гибели;

3) энергетические источники могут расходоваться либо на синтез ингибиторов, либо на блок синтеза критических компонент;

4) может происходить деструкция определенных компонент клетки, что оказывает существенное влияние на гибель (Lockshin, Zakeri, 1991).

Радиационно-индуцированный апоптоз наблюдается в интерфазе перед клеточным делением. Он возникает вследствие потери способности к репарации ДНК (Dewey et al.,1995).

Радиация действует на ядерные процессы в клетке через серию событий клеточного метаболизма. Облучение в дозах 0.1-1 Гр. приводит к апоптозу в лимфоидных и стимуляции в других клетках, при этом активируется транскрипция тех же самых генов, что и при физиологической активации [89].

Облучение активирует ПТК, что видно из фосфорилирования тирозина в некоторых белках, и это сопровождается радиационным активированием ПКС, зависимым от ПТК. От ПКС зависит транскрипция генов c-jun, с-fos, c-myc и гена для ИЛ2.

Если радиационно-индуцированная гибель требует активации ПКС [27], то активаторы ПКС должны усиливать радиационный эффект.



1.4. Молекулярные механизмы апоптоза.

Проблема исследования молекулярных механизмов запрограммированной гибели клетки стала в последние годы одной из самых трудных и актуальных проблем биологических наук. Трудность этой проблемы, очевидна: несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор остаются не исследованными механизмы этого явления [19], не до конца выяснена регуляция апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме [23]. Актуальность этой проблемы определяется взаимосвязью нарушения регуляции процесса запрограммированной гибели клетки с большинством заболеваний. Выявление конкретных механизмов нарушения регуляции апоптоза, сопровождаемых конкретными заболеваниями, позволит определить этиологию и патогенез данных заболеваний [35]. И как следствие этого  возможность коррекции нарушения регуляции запрограммированной гибели клетки. Апоптоз, как уже доказано, является генетической программой самоликвидации клетки, наблюдающийся при физиологических условиях, недостаточных для индуцирования гибели клеток по типу некроза (Gershenson L.E. et al., Sen S. et al.).

Тимоциты являются распространенным объектом для исследования апоптоза (например, Golstein P. et al.,1991; Krammer P H et al.,1991; Stewart B.W.,1994) , в силу своего свойства испытывать апоптоз в процессе негативной селекции (Nossal, 1994). Кроме того, они весьма чувствительны к любым повреждающим воздействиям. Достаточно широко освещена в литературе выживаемость тимоцитов при воздействии глюкокортикоидов (например, ) и ионизирующей радиации (например, Хансон К П., Комар В Е.,1985). Практически ничего нет о выживаемости тимоцитов при УФС облучении.

В 1992г. Девари с соавт. показал, что в клетках HeLa S3 первым регистрируемым событием после УФС-облучения (254 нм, 40 Дж/м2) является активация Src тирозиновых киназ, которая приводила в конечном счете к активации транскрипционного фактора AP-1 и окислительному стрессу. Ингибиторы тирозиновых протеин киназ (генистеин и тирфостин) блокировали этот УФС-ответ HeLa клеток. Поэтому им представлялось целесообразным выяснить, не является ли активация тирозиновых киназ необходимой стадией в УФС-ответе тимоцитов. Для этого клетки предварительно инкубировали с генистеином (74 мкМ) или тирфостином В46 (5, 10, 20 и 35 мкМ), затем облучали в разных дозах и исследовали клеточную гибель. Как показали эксперименты, ингибиторы тирозиновых киназ не оказывали существенного влияния ни на индукцию, ни на подавление апоптоза в тимоцитах ультрафиолетовым облучением (данные не приводятся). Отсюда можно предположить, что в тимоцитах крыс активация тирозиновых протеинкиназ вероятно не является инициирующим событием в УФС – ответе [44].

В кортикальных тимоцитах сигнальные пути при апоптозе такие же, что и при инициации пролиферации и так же зависят от типа инициирующего сигнала. При стимуляции апоптоза в тимоцит поступает необходимый для клеточного деления фактор  ИЛ-1, действующий, возможно, через увеличение глиацилглицероловой продукции. Антитела антиСД3 для человека и антиThy-1 для мышей не индуцируют клеточную пролиферацию сами по себе, это происходит через стимуляцию фактора ИЛ-2, ускоряющего вход в фазу S клеточного цикла [2]. В опосредованную ТКР продукцию ИЛ-2 вовлекаются также системы вторичных мессенджеров. ИЛ-1 поддерживает пролиферацию в присутствии лектин митогена и в результате определяет выработку диацилглицерола. Инкубация тимоцитов с ИЛ-1 ведет к потере эндонуклеазной активности даже в изолированных ядрах тимоцитов [15].

Апоптоз тимоцитов  это одна из лучших характерных экспериментальных моделей апоптоза, индуцируемого различными стимулами, такими, как глюкокортикоиды, ионизирующая радиация, антитела и токсины. Конечно, это наталкивает на мысль, что оксидативный стресс является общим медиатором апоптоза. Однако, мало известно о продуцировании и возможной функции ROI в тимоцитах [16].

Каталаза, или супероксид дисмутаза, не оказывает влияния на внутриклеточную флуоресценцию предположительно из-за собственной малой проницаемости внутрь клеток. Однако N-acetyl-L-cysteine значительно ухудшает флуоресценцию дозо-зависимым образом [5].

В противоположность нейтрофилам и макрофагам, чьи супероксидные анионы являются выброшенными из мембрано-связывающей NADPH-оксидазы, продуцирование ROI тимоцитами начинается, вероятно, из митохондрии, как показывает ингибирующий эффект внесения ротенона или антимицина А [9].

ПКС является важным элементом сигнальных путей, задействованных при апоптозе. Известно, что ингибитор ПКС H-7 способен ингибировать апоптоз тимоцитов, вызванный различными апоптогенными воздействиями. Sakurai с соавторами показали, что Н-7 способен также вызывать апоптоз тимоцитов мыши в дозозависимой манере.



Достарыңызбен бөлісу:
  1   2   3


©netref.ru 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет